人乳(human milk或breast milk)是最适合婴儿消化系统生理、满足其生长发育需求的食品,含有丰富的优质蛋白质。人乳中的蛋白质分为酪蛋白和乳清蛋白等,其中酪蛋白占总蛋白质的30% ～35%[ 1, 2 ],含有 β -酪蛋白和 κ -酪蛋白(主要是前者[ 3, 4 ])。酪蛋白和乳清蛋白的比例在泌乳期前40天大约是20 ∶ 80～30 ∶ 70,在泌乳期40天以后大约是40 ∶ 60～50 ∶ 50[ 5, 6 ],这个变化规律可作为指导婴儿配方食品添加蛋白质基料的依据。
β -酪蛋白作为一种磷酸化蛋白[ 7 ],它的合成和分泌以及磷酸化修饰等是研究激素、细胞外基质对乳腺细胞泌乳作用以及消化代谢研究的有效标志。据推测,人乳 β -酪蛋白的磷酸化位点以及数量与酪蛋白和Ca2+离子结合数量等相关,也影响其他二价离子如锌的吸收[ 8 ]。在消化过程中,磷酸化的 β -酪蛋白被降解成多种具有生物活性的肽段,并能够引起行为、消化代谢、激素、免疫、神经和营养等多方面的调节。
基于上述 β -酪蛋白的特点,目前国内外已有在婴幼儿配方食品中添加牛 β -酪蛋白的产品,以适应婴幼儿的营养需要。尽管婴儿配方乳中蛋白质主要以牛乳蛋白为基料,但与牛乳相比,人乳酪蛋白胶粒较小(30～75 nm),结合的钙和磷较少,水化度也是牛乳酪蛋白胶粒的2倍,这些使得人乳酪蛋白酸凝固后的凝块柔软而细小,有利于蛋白酶的消化,易于婴幼儿小肠的吸收。
关于适合中国婴幼儿营养生理学需求的中国人乳 β -酪蛋白信息很少,以至于不知道其二级和三级结构是什么样,功能特点是什么。要想了解中国人乳 β -酪蛋白结构的生物学信息,首先需要从中国人乳中分离纯化出 β -酪蛋白,并且确定分离纯化方法的有效性。人乳酪蛋白和牛乳酪蛋白不同,如可溶性乳清蛋白含量不同、两个物种之间的酪蛋白子单元有明显区别,因此两种酪蛋白的分离分析方法不可能完全相同,如离心后调整牛奶pH值至4.6[ 9 ],就不能直接用于人乳。
分离牛乳、牦牛乳酪蛋白常用快速蛋白液相色谱[ 10, 11, 12, 13 ],分离人乳酪蛋白常用DEAE色谱[ 14, 15, 16 ]。DEAE-Sepharose Fast Flow是常用的离子交换介质之一,它能在比较温和的条件下分离蛋白质,使其更好地保持其生物活性,是分离酪蛋白、乳清蛋白和相对分子质量较低的蛋白质的有效离子交换树脂[ 17 ]。但由于市场上没有商业化的人乳 β -酪蛋白标准品,故用DEAE-Sepharose Fast Flow分离出的蛋白质无法通过SDS-PAGE进行鉴定。
为建立并评价从中国人乳样品中分离提取 β -酪蛋白的方法,验证方法的可靠性,本研究通过离心脱脂、调节等电点等方法沉淀蛋白质,使得酪蛋白解离出来;然后用平衡缓冲液溶解酪蛋白,对溶液进行阴离子交换色谱分离;再通过Western-Blot法和基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱法(MALDI-TOF/TOF MS)分别对洗脱液进行鉴定,证明 β -酪蛋白能被成功地分离出来。此方法是其他传统的 β -酪蛋白分析鉴定方法如特殊染色法[ 5 ]不可比的。
收集健康中国人哺乳期女性在不同泌乳阶段(7～183 d)的乳汁,共8位女性,样本采集时间分别为泌乳后7、12、20、30、38、50、122和178 d,各100 mL。采集乳样前用消毒纸巾擦拭乳晕及四周,用吸奶器采集乳样于消毒的奶瓶内,分装到10 mL消毒的离心管中并冻存在-20 ℃冰箱中待检。
样本(10 mL)在4 ℃条件下,以10 400 g的离心力离心30 min。样本分为3层,其中乳脂部分在上层,乳清部分在中层,乳粒部分在底部,避开乳脂层,吸取含有酪蛋白的乳清部分备用。
Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸钠(SDS)、 β -巯基乙醇(2-ME)、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘油、考马斯亮蓝(CBB)R-250、过硫酸铵(AP)、溴酚蓝、氯化钙、盐酸、95%乙醇、甲醇、冰乙酸均为分析纯;四甲基乙二胺(TEMED)、预染蛋白质Marker(Prestained Protein Ladder)、尿素、氯化钠和二乙胺基乙基纤维素琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose Fast Flow);兔抗人 β -酪蛋白多克隆抗体、HRP-羊抗兔抗体(Abcam公司)、二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine, DAB)显色液(Tiangen公司)。
GL-21M高速冷冻离心机(上海离心机械研究所); DELTA 320 pH计和PL 2002电子天平(上海梅特勒托利多仪器有限公司);冷冻干燥机(美国Labconco公司); DYY-10C型电泳仪(北京六一仪器厂); GIS-2020数码凝胶成像分析系统(上海天能科技有限公司); AKTA purifer 100蛋白质纯化仪(美国GE公司); ZipTip C18微量层析柱(美国GE公司), AB 4700 MALDI TOF/TOF串联质谱仪(美国Applied Biosystems公司)。
取一份人乳样品,用1 mol/L HCl调节pH至4.3以沉淀酪蛋白,再加入60 mmol/L CaCl2溶液,1 h后,样本在4 ℃条件下以离心力40 000 g离心30 min,收集酪蛋白。洗涤3次,弃去上清液,收集酪蛋白沉淀。将沉淀冷冻干燥,即为酪蛋白粗品。
采用Tris-甘氨酸不连续电泳体系,浓缩胶5%(质量分数),分离胶12%(质量分数),浓缩胶电压为80 V,分离胶电压为120 V,进行SDS-PAGE分离。将1.2节得到的酪蛋白样品与样品缓冲液(由0.6 mL 1.0 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)、2 mL 100 g/L SDS、5 mL 50%(v/v)甘油、1 mL 10 g/L 溴酚蓝、0.5 mL 2-ME组成)以1 ∶ 4的体积比混合后,于沸水浴中煮2～5 min后进行电泳。然后进行考马斯亮蓝染色后脱色[ 18 ]。用凝胶成像仪对电泳图片进行扫描,然后用凝胶成像软件对图像进行处理和分析,根据各个谱带峰面积的大小,计算出酪蛋白粗品中蛋白质的相对含量。
称取400 mg酪蛋白粗品溶解于50 mL的平衡缓冲液(20 mmol/L 的Tris, 3.3 mol/L 的尿素)中,用1 mol/L NaOH调pH至9.5。样本在20 ℃水浴锅中间断性搅拌0.5～1 h。充分溶解后,在4 ℃条件下以 10000 g离心30 min,上清液用0.45 μ m滤膜过滤,过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱。用含0.3 mol/L NaCl、3.3 mol/L 尿素的Tris-HCl缓冲液(pH 9.5)连续梯度洗脱被吸附的蛋白质,收集A280nm处的洗脱峰。
用SDS-PAGE对所得组分进行检测,并与预染蛋白质Marker进行对比,确定目的峰及相对含量。把目的洗脱峰收集液置于截留量为14 kDa的透析袋中,在4 ℃条件下透析除盐,中途更换几次透析液,透析至电导率恒定。然后将样本进行冷冻干燥,于-20 ℃冰箱中保存。
将阴离子交换色谱收集到的非特异洗脱液进行SDS-PAGE电泳,经半干式电转仪转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上,用含5%(质量分数)脱脂奶粉的PBS(0.1 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液,pH 7.4)室温封闭2 h,再用兔抗人 β -酪蛋白多克隆抗体(抗体 ∶ PBS=1 ∶ 400, v/v)室温孵育过夜,放入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体的PBS缓冲液(抗体 ∶ PBS=1 ∶ 3000, v/v)室温孵育2 h,用PBS洗涤3次,最后加入显色液,避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
将条带切成约1 mm3的胶粒,装入Eppendorf管中,用含50% (v/v) 乙腈(ACN)的25 mmol/L 碳酸氢铵脱色液100 μ L浸泡胶粒,放置5～10 min,重复此步骤至颜色褪尽,真空干燥至胶粒变为白色颗粒,加入100 μ L 10 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)于56 ℃水浴中还原,再加入100 μ L 25 mmol/L 碘乙酰胺(IAA)于暗处室温放置1 h,吸尽液体后离心干燥。加入40 μ L 10 ng/ μ L的胰蛋白酶,4 ℃放置90 min后,37 ℃孵育过夜。向胶粒中加入50 μ L 5%(v/v)的三氟乙酸(TFA), 40 ℃水浴1 h,离心后收集上清液,再加入50 μ L 2.5% (v/v)的TFA和50%(v/v)的ACN的混合液,30 ℃水浴1 h,收集上清液。合并上清液,真空干燥。
将酶切后的样品干粉用23 μ L 0.1% (v/v)TFA溶解,用ZipTip C18柱脱盐。将脱盐后的样品与 α -氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)按1 ∶ 1混匀后点于靶上,反射正离子模式和TOF/TOF模式检测。
反射正离子检测模式:离子源加速电压为20 kV, N2激光器,激光波长337 nm,激光频率200 Hz,离子延迟提取时间330 ns,质谱信号单次扫描累加 2000 次,使用peptideⅡ standard kit (Bruker)离子峰(m/z 400～4000)校正,质量扫描范围m/z 500～5000。
TOF/TOF检测模式:离子源电压1 kV, N2激光器,激光波长337 nm,激光频率200 Hz, Timed ion selector(TIS)模式,质谱信号单次扫描 2500 次,使用peptideⅡ standard kit(Bruker)离子峰(m/z 70～1700)校正,扫描范围m/z 70～1700。
人乳中蛋白质主要是乳清蛋白和酪蛋白两大类。为了从乳清蛋白中分离出酪蛋白,采用等电点沉淀的方法,即用HCl调脱脂乳pH,使全酪蛋白沉淀,实验结果表明在泌乳后7、12、20、30、38、50、122、178 d人乳蛋白质种类无显著差异。由此可知,不同泌乳阶段人乳中均含有酪蛋白成分,选用不同泌乳阶段的人乳不会影响研究结果。
取备用的含酪蛋白乳清部分,比较在不同pH条件处理下酪蛋白的分离效果,对其进行了SDS-PAGE电泳。可以看到调节pH值后,乳清蛋白明显减少,当pH=4.3时,能使更多的酪蛋白沉淀;然而,相应的酪蛋白部分仍然包含部分乳清蛋白,这与Nagasawa等[ 19, 20, 21 ]的叙述一致。对各个泳道进行光密度扫描分析,计算出不同pH条件下处理得到的酪蛋白的相对含量,如表1所示。可以看出,当pH=4.3时,得到的酪蛋白相对含量最高,可以将人乳中大部分的酪蛋白分离出来。因此选择pH 4.3为最优pH条件。
取2.1.1节最优pH条件下处理过的含酪蛋白乳清部分,比较在不同离心力条件处理下酪蛋白的分离效果,对其进行了SDS-PAGE电泳。可以看出,低速离心得到的杂蛋白多于高速离心。对各个泳道进行光密度扫描分析发现,当离心力为40000 g和2000 g时,处理脱脂乳得到的酪蛋白的相对含量分别为70.40%和65.98% 。综上所述,高速离心处理脱脂乳分离酪蛋白效果更好。
为比较在不同CaCl2浓度处理下酪蛋白的分离效果,对其进行了SDS-PAGE电泳。对各个泳道进行光密度扫描分析,计算出不添加CaCl2时得到的酪蛋白的相对含量为68.65% ,当CaCl2浓度为30、60、120 mmol/L 时,处理得到的酪蛋白的相对含量分别为73.98% 、77.37% 、71.28% 。可以看出,不同CaCl2浓度条件下处理酪蛋白对其分离效果是有影响的,当CaCl2浓度为60 mmol/L 时,酪蛋白组分的相对含量最高,沉淀效果最好。这可能是因为酪蛋白中 β -酪蛋白对Ca2+敏感[ 22 ],当Ca2+存在时,它能更好地从酪蛋白胶束中解离出来并聚合,最终沉淀。因此钙盐沉淀的方法可使更多的酪蛋白被分离出来[ 23 ]。
按1.4节条件将酪蛋白样品溶于平衡缓冲液中,用缓冲液进行连续梯度洗脱,得到如图1所示的3个明显的峰。其中峰Ⅰ与其余各峰分离很好,峰Ⅱ和峰Ⅲ未完全分开。收集3个峰的洗脱液用于下一步的SDS-PAGE鉴定。
各峰洗脱液进行SDS-PAGE电泳后,采用考马斯亮蓝染色,结果见图2。从图2可以看出峰Ⅰ和峰Ⅱ不是单一的蛋白质,峰Ⅲ为单一的蛋白质,与Kunz等[ 5 ]叙述的 β -酪蛋白的相对分子质量及最后被洗脱出来的现象一致。结合文献[ 24 ],初步判断图1中峰Ⅲ为 β -酪蛋白的目标峰。
Western Blot法的鉴定结果如图3。结果表明,此蛋白可以和兔抗人 β -酪蛋白特异性结合,此蛋白即为人乳 β -酪蛋白。
采用MALDI-TOF/TOF MS对分离纯化得到的 β -酪蛋白进行更准确的鉴定分析。人乳 β -酪蛋白共有226个氨基酸,其理论序列已经测出。由于胰蛋白酶酶解位点是R和K,故可用胰蛋白酶酶解 β -酪蛋白。蛋白条带酶切后经MALDI-TOF/TOF MS检测,扫描范围为m/z 70~ 1700,一级反射质谱图见图4,选择其中信号强度高的m/z 1633.89 和m/z 1486.72 肽段进行串联质谱序列分析。在m/z 1633.89 和m/z 1486.72 的二级质谱图中都可以看到连续的b和y离子峰(见图5和图6),表明2个丰度很高的m/z 1633.89 和m/z 1486.72 肽段分别与 β -酪蛋白的氨基酸序列VLPIPQQVVPYPQR和SPTIPFFDPQIPK匹配。
一级质谱和二级质谱的Peaklist数据用Mascot检索,目标蛋白得分195,将一级质谱数据与此蛋白质的理论肽谱进行比对,序列覆盖率为50% ,与Poth等[ 24 ]采用二维电泳(2-DE)结合MALDI-TOF/TOF MS的方法对人乳 β -酪蛋白进行分离和鉴定磷酸化位点时得到的结果一致, β -酪蛋白组分质谱图谱中共有8段肽段与其理论肽段匹配,分别是m/z 725.34, m/z 898.52, m/z 914.50, m/z 1485.71, m/z 1632.88, m/z 1948.77, m/z 2086.92 和m/z 4036.24,其质谱峰归属见表2。
综上所述,根据一级质谱和二级质谱的鉴定结果,可以确认纯化的组分为 β -酪蛋白。
本研究以中国人乳为研究对象,通过离心脱脂、调节等电点,沉淀酪蛋白。对所得沉淀物进行DEAE离子交换,用pH 9.5的Tris缓冲液进行连续梯度洗脱,可将 β -酪蛋白分离纯化出来。用Western Blot法和MALDI-TOF/TOF MS法对分离得到的 β -酪蛋白分别进行验证,证实目标产物为 β -酪蛋白。
本研究对中国人乳 β -酪蛋白蛋白质组学分析具有重要的参考意义,同时也为开发符合中国人乳特点的婴幼儿配方乳制品奠定理论基础。
2013, Vol. 31 Issue (5): 429-434
PDF (413KB)
2013, Vol. 31 Issue (5): 429-434
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