植物激素对植物的种子萌发、生长、开花、成熟、衰老、休眠等生命活动起直接或间接的调节、控制作用[ 1, 2 ]。小麦是我国三大农作物之一,如何调控其生长发育,进而促进分蘖,提高产量和品质,备受农业科研人员的关注。了解小麦内源激素的变化规律,对于研究其产量和抗性等具有重要的生产实践价值[ 3, 4, 5 ]。
植物内源激素含量的测定方法主要有酶联免疫、同位素标记和高效液相色谱等。其中高效液相色谱法具有重现性好、分辨率和灵敏度高、分析速度快等优点,近几年应用逐渐增多[ 6, 7, 8 ];其中各种激素分别检测较多[ 9, 10 ],虽然效果好,但耗时较长。为了快速分离、检测植物中的多种内源激素,应优先考虑多种激素的同时检测。内源激素在体内含量甚微,种类复杂,结构各异,对温度等条件敏感[ 11 ]。如吲哚乙酸(IAA)和玉米素(ZT)属于生物碱,赤霉素(GA3)和脱落酸(ABA)是萜类化合物,水杨酸(SA)属于酚酸类,使用HPLC同时检测,难以实现每种物质都很好分离的效果[ 12 ]。因此有必要对HPLC方法进行优化。同时,选择合适的提取方法也是关键[ 13 ]。恰当的预处理有利于激素的富集和干扰物质的去除。目前,关于小麦内源激素的提取、分离、测定方法相对较少。尤其近年来被认为是一种新的植物激素的物质——水杨酸(SA)[ 14 ]的高效液相色谱法测定鲜有报道。本实验从洗脱液梯度、pH和检测波长的切换等方面对激素分离条件进行优化,对小麦中的IAA、ABA、GA3、ZT、SA进行分离和测定,建立一种分析小麦激素的有效方法,从而为小麦内源激素调节和控制小麦的生长、衰老等研究提供关键技术。
Agilent 1200高效液相色谱仪,Agilent 1200系列泵,可变波长检测器,TU1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司), RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂), 320-S pH计(Mettler Toledo), HR-120电子天平(A&D公司), KQ500DE型超声波脱气,Beckman Allegra 64R冷冻离心机。
玉米素、赤霉素、生长素、脱落酸、水杨酸标准品(Sigma公司,纯度≥99% ),甲醇、乙酸(色谱级,美国Tedia公司),石油醚、乙酸乙酯(分析纯,国药集团化学试剂有限公司),实验用水为超纯水。所有试剂在使用前均用0.45 μ m微孔滤膜过滤。
用甲醇配制0.2 g/L 生长素、0.1 g/L 玉米素、0.1 g/L 脱落酸、2.5 g/L 赤霉素、0.4 g/L 水杨酸的混合标准溶液。
按参考文献[ 15 ]的样品处理方法并予以改进和优化。称取新鲜小麦叶2 g、根5 g,分别加入10 mL预冷的80%(如无特殊说明均为体积分数)甲醇,冰浴研磨成浆,保鲜膜密封后于4 ℃冷浸过夜。然后于4 ℃条件下以 8000 r/min 离心10 min得上清液,残渣加入8 mL 80%的冷甲醇离心10 min后合并上清液。全部滤液于40 ℃下减压浓缩至原体积的1/3,加入30 mL石油醚萃取脱色3次,弃醚相。水相用20 mL乙酸乙酯萃取3次,合并酯相,40 ℃下减压蒸干。加入pH 3.5的乙酸溶液2 mL,过Sep-Pak C18小柱纯化,用甲醇洗脱,收集后在40 ℃下减压浓缩至干。用流动相溶解并定容至2 mL,经0.45 μ m微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。
色谱柱为Eclipse XDB-C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μ m, Agilent公司),流动相A为甲醇,B为乙酸的水溶液(pH 3.6),梯度条件为0～7 min 20%A, 7～10 min 20%A～28%A, 10～17 min 28%A, 17～19 min 28%A～40%A, 19～35 min 40%A。流速为1 mL/min,进样量为10 μ L。检测器波长设置为254 nm; 14.5 min时切换到240 nm; SA洗脱后即18 min时切换回254 nm。检测温度为室温。
在小麦生长发育过程中,植物内源激素含量甚微,且与其他各类物质并存,应用HPLC检测时,不可避免地相互干扰,呈现分离效果差等现象。因此,如何有效减少杂质是激素提取的关键。分别以水、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚作为溶剂,发现甲醇的提取率高、杂质较少。采用甲醇为提取溶剂,分别设置浸提时间为8、12、16、20、24 h。小麦中玉米素、水杨酸和赤霉素等激素的提取效率随提取时间的延长而升高,16 h以后达到较高水平,再延长时间增加不明显。经石油醚脱色和乙酸乙酯萃取后,杂质的干扰依然较大,因此选择进一步纯化处理。参照文献[ 15, 16 ]的样品处理方法,过聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)柱、Sep-Pak C18小柱进行纯化,结果发现检测不出水杨酸。由于水杨酸含量低且易被PVPP吸附,因此选择过Sep-Pak C18小柱纯化。实验结果表明,5种激素提取效果良好。
以甲醇(A)-水(B)两相作为流动相,选择不同比例的流动相对激素进行分离。用等度洗脱进行最适条件摸索,分别设定甲醇(A相)为15% 、17% 、20% 、23% 、26% 、28% 、35% 、40% 。结果发现当甲醇含量高于20%时,玉米素在2～3 min洗脱出来,容易与样品中的杂质峰重叠;而甲醇含量低于20%时,出峰时间过晚,检测时间变长;甲醇含量为20%时,其他激素峰拖尾严重。经过优化,发现当甲醇含量上升到28%时,GA3和SA的分离度高;当升高到40%时,IAA和ABA的分离效果好。综合考虑各激素分离度、峰形的对称性以及缩短分析时间,最终采用1.4节所述的梯度洗脱条件。
乙酸可以抑制样品的解离,改善峰拖尾现象,因此在流动相中加入乙酸。不同浓度的乙酸对样品的分离也有较大影响。分别用pH 3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0的乙酸溶液进行试验。结果显示当pH＜3.6时,出峰时间过早,易于与样品中的杂质峰重叠,干扰实验结果。当pH提高时,各激素保留时间也相应变长。而当pH 3.8时,赤霉素与水杨酸峰部分重叠。当pH达到4.0时各激素的保留时间延长,检测时间也相应增加。因此，选择pH 3.6的乙酸的水溶液为流动相B,各峰的分离度以及保留时间都较好。
在190～400 nm范围内,用紫外可见分光光度计扫描混合标准溶液。各激素的最大吸收波长分别为:IAA, 250 nm; ABA, 246 nm; GA3, 210、255 nm; ZT, 262 nm; SA, 240 nm。参照文献[ 17 ]方法,在254 nm波长下对激素的标准品及样品进行测定并在GA3出峰前将检测波长切换到210 nm(GA3的最大吸收波长)。结果发现,由于210 nm与甲醇的最大吸收波长接近,GA3峰形较差;而254 nm虽然不是GA3的最大吸收波长,但是在此波长下其吸收值较高,而且可以有效避免与流动相的干扰。因此首先以254 nm作为激素的检测波长,在此波长下SA的响应值低、峰形差(图1a)。而切换波长更利于待测组分的分析检测,因此选择在SA出峰前(14.5 min)将检测器波长切换到240 nm,待出峰完全结束后(18 min)切回254 nm(图1b)。
分别考察了流速为0.6、0.8、1.0、1.2和1.5 mL/min 时的分离效果。当流速小于1 mL/min,检测时间延长;当流速为1.2或1.5 mL/min,赤霉素和水杨酸的色谱峰重叠,分离效果差。流速为1 mL/min时,各激素能在35 min内很好的分离。
在优化的色谱条件下,对混合的标准样品进行检测。从图2中可以看出,5种激素能够较好地分离和检出。
以5种激素的标准溶液为原液进行逐级稀释,在优化的色谱条件下分析。以峰面积为纵坐标(y),质量浓度为横坐标(x, mg/L),计算各内源激素的回归方程、相关系数和线性范围,同时按3倍信噪比得到各激素检出限(见表1)。由结果可知,标准品浓度与峰面积的相关性良好。
取小麦根样品2 g,按照1.3节方法制备样品并用上述条件进行测定。如图3所示,小麦根中的激素能得到很好的分离。随后进行加标回收试验,结果见表2。
测定孕穗期小麦样品中的激素含量,结果显示小麦叶中含玉米素0.962 μ g/g、赤霉素2.54 μ g/g、水杨酸2.80 μ g/g、生长素0.523 μ g/g、脱落酸0.736 μ g/g。小麦根中含玉米素1.10 μ g/g、赤霉素1.36 μ g/g、水杨酸0.480 μ g/g、生长素0.377 μ g/g、脱落酸0.503 μ g/g。
通过优化小麦中5种内源激素的提取条件以及色谱条件,建立了一种简单、有效的高效液相色谱分析方法。分离效果理想,加标回收率达96% ～98% ,检出限为0.195～0.976 mg/L。方法满足激素定量分析的测定要求,为进一步检测小麦生长过程中内源激素的变化、激素代谢与小麦的生长、衰老等相关性研究提供了关键技术。
2013, Vol. 31 Issue (8): 800-803
PDF (819KB)
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