糖类一般指多羟基醛、多羟基酮或水解后产生这些化合物的一大类有机化合物[ 1 ],它是生命过程中的主要能量来源[ 2 ]。糖类在食品中影响食品质构、风味、稳定性、甜味等性质,同时也是食品中的主要营养素。食品中糖类的种类及含量的多寡直接影响到食品的质量与营养价值[ 3 ]。随着人们生活水平的提高,食品工业的发展,人们的膳食结构发生了急剧变化,引发了各种“吃糖”过多所导致的健康问题,如龋齿、肥胖、高血脂、高血压、糖尿病和冠心病等。
目前国内对食品中糖含量的检测应用和研究较多的方法主要包括化学检测法[ 4, 5 ]、高效液相色谱-荧光检测法[ 6 ]、高效液相色谱-示差折光检测法[ 7, 8, 9, 10 ]、离子色谱法[ 11, 12 ]等。但是化学法耗时较长,只能测定总糖和还原糖的含量,无法进行准确的定性定量分析;高效液相色谱-荧光法由于需要待测物具有荧光特性,用于糖的检测时需要对其进行衍生化处理,降低了其通用性;目前国家标准GB/T 22221-2008和GB/T 22222-2008中测定单糖、双糖和糖醇含量采用了高效液相色谱-示差折光法,该法灵敏度较低,且无法进行梯度洗脱,使得其难以用于多种糖的同时分离检测;离子色谱法用于糖含量的检测研究较多,其灵敏度较好,但是糖类在电极表面会发生氧化还原反应,从而影响方法的准确性。也有采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(evaporative light-scattering detector, ELSD)[ 13, 14, 15, 16 ]来检测少数糖的方法,但目前尚无采用该法对10多种糖和糖醇进行同时分离检测的相关报道。
本文针对食品中常用的单糖(果糖、葡萄糖、木糖)、双糖(蔗糖、麦芽糖、乳糖)、低聚果糖(蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖)和糖醇(木糖醇、甘露醇、麦芽糖醇),共计13种,采用NH2柱进行梯度洗脱分离,并结合新一代的通用型检测器 蒸发光散射检测器(ELSD)进行检测,从而建立了高效、准确、快速、灵敏的多种糖类同时分离检测的技术,为糖类的检测、应用和监管提供技术支撑。
木糖(xylose)、果糖(fructose)、葡萄糖(glucose)、蔗糖(sucrose)、麦芽糖(maltose)、乳糖(lactose)、赤藓糖醇(erythritol)、木糖醇(xylitol)、甘露糖醇(mannitol)、麦芽糖醇(maltitol)等标准品来源于Dr. Ehrenstorfer GmbH;低聚果糖(fructooligosaccharides):蔗果三糖(1-kestose, 99.0% )、蔗果四糖(nistose, 99.0% )、蔗果五糖(1F-fructofuranosyl nystose, 99.0% ), HPLC级,来源于和光纯药工业株式会社;乙腈(99.9% ,色谱纯)来源于TEDIA公司。实际样品为市售。
Agilent 1200 series高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司); Alltech 3300蒸发光散射检测器(美国格瑞斯公司); XS204电子天平(瑞士梅特勒-托利多)。
分别准确称取各种糖、糖醇标准品各0.25 g(精确到0.1 mg)于150 mL烧杯中,用1 ∶ 1(体积比,下同)的甲醇-水溶解,转移并定容至25 mL容量瓶中,于4 ℃冰箱中保存。
分别取配制好的各单标准储备液用1 ∶ 1的甲醇-水配成不同浓度的混合标准溶液,于4 ℃冰箱中保存,待测。
不含蛋白质样品:称取样品0.5～50 g(用m表示,可根据含糖量增减样品量)于150 mL烧杯中,用1 ∶ 1的甲醇-水溶解,超声振荡5～10 min,转移并定量至100 mL容量瓶中,用滤纸过滤(蜂蜜类样品可以不过滤),取滤液过0.22 μ m水相滤膜至样品瓶中,待测。
含蛋白质样品:加15%(质量分数)三氯乙酸溶液溶解,其他同上。
色谱柱:ZORBAX NH2柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m,安捷伦科技有限公司);柱温:30 ℃。流动相:A,乙腈;B,水。梯度洗脱程序:0～1 min, 80%A; 1～5 min, 80%A线性增长至85%A; 5～20 min, 85%A线性降低至70%A; 20～32 min,保持70%A。流速1 mL/min,进样量10 μ L。蒸发光散射检测器的检测条件:漂移管温度为60 ℃,载气为高纯氮气(99.999% ),载气流速为1.2 L/min,增益为1。
将样品溶液中各糖的质量浓度C代入公式X=CV/(1000m)×100%中计算样品中糖的含量，式中:X为样品中的糖含量(% ), C为样品提取液中糖的质量浓度(g/L), m为样品质量(g), V为定量体积(mL)。
糖类检测较常用的色谱柱有NH2柱和钙型阳离子柱。由于对多种糖的混合标准液进行同时分离时,NH2柱与不同糖分子所形成氢键的结合力强弱不同,在分离时更具有优势,因此,选择了NH2柱,同时流动相选择乙腈-水。通过改变乙腈-水的比例,发现各种糖的保留时间会发生显著变化,并且随着水的比例的增加而保留时间不断缩短;经过优化,得到了1.2.4节的梯度洗脱程序。
ELSD的两个较重要的参数分别是漂移管温度和载气流速,两者对组分的保留时间影响较小,但对信噪比(S/N)的影响较大,一般建立适当的HPLC-ELSD分析方法时,需对这两个参数进行优化。漂移管温度对基线与噪声的影响没有明显的规律,优化的原则一般是选择达到最佳信噪比时的最低漂移管温度;因为漂移管温度越高,流动相趋向沸腾,会逐渐降低信噪比;最佳的载气流速是在可接受的噪声的基础上,产生最高检测响应值的最低流速;综合以上考虑,经过实验摸索(见图1),确定最佳漂移管温度为60 ℃,最佳载气流速为1.2 L/min。
综合色谱和ELSD条件的优化结果,我们确定混合标准溶液分离的最佳条件如1.2.4节所示,此时能实现13种糖和糖醇的有效分离(见图2)。
将10 g/L 的各种糖单标准溶液依次稀释配制成质量浓度为5、3、2、1、0.5、0.1、0.05 g/L 的系列混合标准溶液,在1.2.4节的色谱条件下检测,根据各峰面积(Y)对质量浓度(X)进行线性回归,得到13种糖和糖醇的标准曲线方程、线性范围和相关系数,结果见表1。将糖混合标准溶液不断稀释至谱图中的信噪比为3,此时的质量浓度为该糖的检出限,结果见表1。
将混合标准溶液在1.2.4节色谱条件下进样6次,测得各组分的峰面积的相对标准偏差均在2.69%与7.21%之间。
以不同类型食品为基质做加标回收试验,各称取3份,1份为空白对照,另2份分别加入1.2.1节中配制的不同体积的各种单标准溶液,进行加标回收率试验,在1.2.4节的分离检测条件下,测得各组分的平均回收率均在96.1%与105.2%之间。表2列出13种糖和糖醇在基质相对复杂的液态乳中的加标回收数据,平均回收率在96.1%至104.4% 。结果表明该方法的准确度较高,可以用于实际样品的检测。
现行有效的测定糖的国家标准方法有GB/T 5009.8-2008《食品中蔗糖的测定》,该标准采用两种方法,第一法为高效液相色谱-示差折光法,第二法为酸水解滴定法;GB/T 22221-2008《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定 高效液相色谱法》,该标准采用高效液相色谱-示差折光法。通过测定蔗糖的含量,将本法与GB/T 5009.8-2008(第二法)、GB/T 22221-2008做比对,样品为木糖醇崂山酥、曲奇饼干、橙汁、红葡萄汁、绿茶5种,比对的结果如表3所示。从表3中可以看出本法测定结果与GB/T 22221-2008结果更为吻合,以mg/g为单位,GB/T 5009.8-2008第二法只能精确到整数位,特别是浓度较低时,准确性不如高效液相色谱法。因此本法操作简单、方便快速、准确性高,可以满足糖类的成分和含量测定的要求。
将本文建立的方法用于22种标签中标注含糖量或者声称低糖、无糖的食品样品检测,结果显示:符合标签的样品只有9种,合格率仅为40.9% ;其中5批蜂蜜只有3批符合国家标准;6批婴幼儿奶粉只有2批产品符合标签明示;11款无糖食品只有4款完全符合;3批无蔗糖食品均检出蔗糖,且含量均大于15% ,其中1批产品的含糖量高于52% 。此次实际样品的分析表明目前市场含糖食品和无糖食品的标签明示和产品实际成分相差较大,急需建立多种糖类的同时检测方法加以验证和规范。
本文建立了食品中木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇等13种单糖、双糖、低聚果糖和糖醇的同时分离检测的高效液相色谱-蒸发光散射检测方法。研究结果表明,该检测方法具有较宽的线性范围,精密度和准确度良好,将其用于食品中以上13种糖和糖醇的测定,简单、快捷、高效。实际样品的检测结果表明,食品标签明示和实际成分相差较大。
2013, Vol. 31 Issue (8): 804-808
PDF (832KB)
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