在前期的工作中,我们得到适用于任意形式的溶剂强度模型和梯度曲线形状的梯度液相色谱保留时间公式^{[ 11 ]}

在梯形梯度(图1)中,流动相组成随时间变化的表达式为

在该情形中,t_R-t₀-t_D>t_P,2, (2)式可写为

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 联苯在梯形梯度坡度上流出时的梯度条件及实验数据 Table 1 Gradient conditions and experimental data for biphenyl eluted at the slope of the ladder-like gradient No. Gradient profilea B tR/min φ Rb Δ φ R/ Δ B c d φ R/dB d RE/%e 1 0 min, 0.60; 5 min, 0.60; 20 min, 0.90; 25 min, 0.90 0.020 18.477 0.777 4.066 3.938 3.25 0 min, 0.60; 5 min, 0.60; 17 min, 0.90; 25 min, 0.90 0.025 17.519 0.797 2 0 min, 0.50; 10 min, 0.50; 30 min, 0.90; 40 min, 0.90 0.020 28.636 0.780 5.225 5.083 2.79 0 min, 0.50; 10 min, 0.50; 32 min, 0.90; 40 min, 0.90 0.018 29.515 0.771 a. see Fig. 1. b. calculated by Eq. (6). c. calculated from experimental data. d. calculated by Eq. (8a) where k( φ R) is calculated from the ln k- φ plot at the average of the φ R values. e. relative error between Δ φ R/ Δ B and d φ R/dB.

表1 联苯在梯形梯度坡度上流出时的梯度条件及实验数据 Table 1 Gradient conditions and experimental data for biphenyl eluted at the slope of the ladder-like gradient

日本岛津(Shimadzu) Prominence液相色谱系统,包括两个LC-20AT输液泵,一个SIL-20A自动进样器,一个SPD-20A紫外检测器,一个CTO-20AC柱温箱,以及LabSolutions色谱工作站等。

联苯(纯度99% )和尿嘧啶(纯度99% )均购自常州润友商贸公司。Ultimate XB C18色谱柱购自月旭材料科技(上海)有限公司。甲醇为色谱纯。实验用水为超纯水。

色谱柱:Ultimate XB C18柱,150 mm×4.6 mm, 5 μ m。流动相:甲醇和水的混合液。柱温为35 ℃;流速为1.0 mL/min;波长为254 nm;进样量为5 μ L。

样品溶液的配制:取尿嘧啶和联苯适量,用60%甲醇水溶液配成质量浓度均为20 mg/L 的溶液。

死时间的测定^{[ 16 ]}:以甲醇为流动相,测定尿嘧啶在色谱柱上的保留时间。然后用一个二通管替换色谱柱,测定尿嘧啶在通过进样阀到检测器之间管路所经历的时间(t_tub)。从尿嘧啶的保留时间中扣除t_tub即得t₀,实验值为1.649 min。

梯度延迟时间的测定^{[ 17 ]}:用二通管替换色谱柱。将水置于A贮液瓶中,甲醇置于B贮液瓶中,检测波长设为205 nm。以100%A瓶溶剂为初始流动相,在2 min时迅速将B瓶溶剂的比例提高至40% ,通过色谱工作站记录流出曲线,并做一级微商,取其顶点所对应的时间减去t_tub+2即得t_D,实验值为2.972 min。

保留时间的测定:以联苯为测试样品,测定其在不同比例的流动相组成以及梯度条件下的保留时间,扣除t_tub即得t_R。

图2

Fig. 2

图2 联苯的ln k- φ 曲线 Fig.2 Plot of ln k vs φ for biphenyl Symbols: open circle, experimental value; solid line, the linear fit to data. The regression equation for the fit is ln k=8.753-9.637 φ , r=0.999.

从(8b)式可知,当溶质在梯形梯度的坡度上流出时,方程等号的右边将始终大于零,即有t_R0＞t_D +t_P,1+t₀。这是因为,图1中点(t_P,1, φ ₀)所对应的 流动相组成到达色谱柱末端的时间为t_D+t_P,1+t₀。如果t_R0＜t_D+t_P,1+t₀,这就意味着溶质将始终处于初始流动相之中,即溶质将会在梯形梯度的第一个等度区间内流出色谱柱,显然这与溶质在坡度上流出的前提条件不符合。因此,(8)式等号的右边将始终大于零。这一结果表明,当增加梯形梯度的斜率时,溶质流出色谱柱所对应的流动相组成也将随之增加。该结论也与表1所得到的实验结果相吻合。

由(12)式可知,如果溶质在梯形梯度的最后一个等度区间内流出色谱柱,同时 φ ₀和 φ ₂不变而仅有梯度的斜率发生变化时,溶质的保留时间将与梯度斜率的倒数呈线性关系。为了验证这一结论,实验中设计了两组梯形梯度条件,见表2。将实验测得的保留时间(t_R)对梯度斜率的倒数(1/B)进行线性回归,得到的相关系数(r)均接近于1,这一结果验证了(12)式的正确性。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 联苯在梯形梯度最后一个等度区间流出时的梯度条件及实验数据 Table 2 Gradient conditions and experimental data for biphenyl eluted at the last isocratic segment of the ladder-like gradient No. Gradient profile 1/B tR/min Regression equation 1 0 min, 0.60; 1 min, 0.70; 25 min, 0.70 10 15.584 tR=0.0338/B+15.235, 0 min, 0.60; 2 min, 0.70; 25 min, 0.70 20 15.927 r=0.999 0 min, 0.60; 3 min, 0.70; 25 min, 0.70 30 16.220 0 min, 0.60; 5 min, 0.70; 25 min, 0.70 50 16.910 0 min, 0.60; 7 min, 0.70; 25 min, 0.70 70 17.618 2 0 min, 0.60; 1 min, 0.60; 2 min, 0.70; 25 min, 0.70 10 16.086 tR=0.0349/B+15.726, 0 min, 0.60; 1 min, 0.50; 3 min, 0.70; 25 min, 0.70 20 16.424 r=0.999 0 min, 0.60; 1 min, 0.50; 4 min, 0.70; 25 min, 0.70 30 16.759 0 min, 0.60; 1 min, 0.50; 6 min, 0.70; 25 min, 0.70 50 17.462 0 min, 0.60; 1 min, 0.50; 8 min, 0.70; 25 min, 0.70 70 18.176

表2 联苯在梯形梯度最后一个等度区间流出时的梯度条件及实验数据 Table 2 Gradient conditions and experimental data for biphenyl eluted at the last isocratic segment of the ladder-like gradient

从(14)式可知,回归方程的截距将与梯形梯度第一个等度区间的终点时间(t_P,1)、梯度延迟时间(t_D)、死时间(t₀)以及溶质在初始和终止流动相中的保留因子(k( φ ₀)和k( φ ₂))相关。将(14)式转化可得

在不指定溶剂强度模型形式的前提下,探讨了梯形梯度洗脱的一些特点。对于溶质在梯形梯度坡度上流出时的情形,推导得到的(8)式表明溶质流出色谱柱所对应的流动相组成将会随着梯度斜率的增加而增加。而对于溶质在梯形梯度最后一个等度区间内流出时的情形,推导得到的(12)式表明,如果初始和终止流动相组成保持不变而仅有梯度的斜率发生变化时,溶质的保留时间将与梯度斜率的倒数呈线性关系。实验中以联苯为样品,C18柱为固定相,甲醇-水为流动相,测定了不同梯形梯度条件下的保留时间,所得到的实验值与理论值相吻合,从而验证了上述方程的正确性。由于推导过程中没有指定溶剂强度模型的数学形式,这些结果将同样适用于非线性溶剂强度模型时的情形(即ln k- φ 曲线为非线性)。在一些实验中,样品在乙腈/水(或缓冲溶液)等流动相体系中会表现出非线性溶剂强度的特点。对于这类情形本文得到的公式将同样适用。这将有助于帮助人们深入认识梯形梯度洗脱的一些特点,从而更好地将其应用于实践之中。