2012年12月我国爆发“速生鸡”事件,曝光鸡在饲养过程中被违规喂食利巴韦林、金刚烷胺等抗病毒药物。违禁抗病毒药物的滥用不仅造成鸡肉风味和品质的下降,更会导致细菌耐药性的发生和药物残留,并通过食物链影响人类健康和破坏生态平衡,造成严重不良后果。美国食品药物管理局(FDA)早于2005年就禁止将人类抗病毒药物用于畜禽类;我国农业部公告第560号中也明确规定抗病毒药物为禁用兽药。
测定利巴韦林的方法主要有放射免疫法[ 1 ]、气相色谱-质谱法[ 2 ]、液相色谱法[ 3, 4, 5 ]、液相色谱-质谱法[ 6, 7, 8, 9 ]等;目前我国测定肉类制品中金刚烷胺的相关报道很少,且集中在液相色谱法[ 10 ]和气相色谱法[ 11 ],仅有2篇文献[ 12, 13 ]采用了液相色谱-串联质谱法。HPLC法灵敏度较低且无法提供结构信息;GC-MS法需衍生后气化,样品处理方法复杂。液相色谱-串联质谱法可提供待测物的结构信息,具有较高的灵敏度和选择性,是同时测定上述两种组分的理想方法。
本文利用三氯乙酸-乙腈作提取液,同时充分利用其能使蛋白质变性的作用,实现提取、净化同时完成。样品中的利巴韦林和金刚烷胺经三氯乙酸-乙腈溶液提取和Supelco LC-SCX小柱净化后,采用BEH Hillic色谱柱进行分离,液相色谱-质谱联用仪检测。该方法和现有文献报道方法相比更为简便快速,能同时测定两个组分,极大地节省了检测时间和成本,对鸡肉中两种药物成分的实际测定结果验证了该方法的高灵敏度和可靠性,结果令人满意。
UPLC-Xevo TQ MS型超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司);微孔滤膜(0.20 μ m,美国Pall公司);超声波清洗器(江苏昆山超声仪器有限公司);小型高速离心机(德国Sigma公司); Aspecxl多通道固相萃取仪(法国Gilson公司); Supelco LC-SCX固相萃取小柱(3 mL,美国Supelco公司)。
利巴韦林标准品(25 mg,中国药品生物制品检定所);金刚烷胺标准品(纯度99% ,德国Dr. Ehrenstorfer公司);三氯乙酸、氨水(色谱级,美国TEDIA公司);乙腈、甲醇(色谱纯,美国Fisher公司);实验用水均由Milli-Q超纯水系统制备。
标准储备液:分别准确称取利巴韦林和金刚烷胺10 mg于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,得质量浓度为1 g/L 的标准储备液,于-18 ℃下避光存储。
混合标准中间液:分别取上述标准储备液各1 mL,用甲醇-水(1 ∶ 1, v/v)溶液配制成质量浓度为10 mg/L 的标准中间溶液,于4 ℃下避光存储。
色谱柱:Acquity UPLC BEH Hillic色谱柱(150 mm×2.1 mm, 1.7 μ m;美国Waters公司)。流动相A为0.1%(如无特殊说明均为体积分数)甲酸溶液,流动相B为甲醇。梯度洗脱程序:0～1.0 min, 20%A～80%A; 1.0～2.0 min, 80%A; 2.0～2.1 min, 80%A～20%A; 2.1～3.0 min, 20%A。流速0.3 mL/min;柱温35 ℃;进样体积5.0 μ L。
电喷雾离子源正离子模式(ESI+);检测方式:多反应监测(MRM);电喷雾电压:3.6 kV;雾化气温度:400 ℃;滞留时间:0.202 s;监测离子对、锥孔电压和碰撞能量等参数见表1。
称取5.00 g鸡肉样品于50 mL离心管中,加入10 mL 1%三氯乙酸溶液-乙腈溶液(1 ∶ 1, v/v),充分漩涡混匀,超声提取30 min。于 8000 r/min 高速离心10 min,取上清液加载至已依次用3 mL甲醇、4 mL 0.1%甲酸溶液活化过的SCX柱中,5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱。收集洗脱液用氮气吹干,1 mL 5%氨水甲醇溶液溶解、定容。过0.2 μ m微孔滤膜,滤液供UPLC-MS/MS分析。
由化学结构式可知利巴韦林与金刚烷胺均属极性化合物(见图1),在纯有机溶剂中溶解度较小,一般选用稀酸溶液、有机溶剂-水的混合溶液、极性较强的有机溶剂或缓冲溶液作提取溶液。本实验对比了乙腈、甲醇、甲酸-乙腈、甲酸-甲醇、三氯乙酸-乙腈、三氯乙酸-甲醇等提取溶液,发现选用1%三氯乙酸-乙腈(1 ∶ 1, v/v)可获得更高的提取效率。同时可利用三氯乙酸使蛋白质变性的功能,使蛋白质构象发生改变,暴露出较多的疏水性基团从而聚集沉淀,在提取的同时实现初步净化。
尝试无需固相萃取小柱,直接采用液-液分配实现净化。鸡肉样品中的脂肪、蛋白质等干扰多,为达到更低的检出限,提取液需能兼顾净化和浓缩双重功能。两种目标分析物均为极性化合物,易溶于水,采用水相提取后很难经液-液再分配进入有机相,无法实现再浓缩,故考虑有机相直接提取浓缩。比较了乙腈、甲醇、酸化乙腈和酸化甲醇等溶剂,发现甲醇会提取到过多的脂肪、蛋白质等干扰物且浓缩耗时过长;而酸化乙腈提取效率较好,并可经正己烷萃取除脂净化而不影响提取效率。但由于未经SPE净化,在UPLC-MS/MS上有较大的基质抑制效应。因此选用SPE方法并对实验条件进行了优化。
采用常规的C18小柱净化,发现利巴韦林和金刚烷胺基本无保留。对比Oasis WCX、Oasis MCX、Supelco LC-SCX 3种离子交换柱。结果显示在WCX柱中二者均不保留;MCX柱中金刚烷胺可保留但利巴韦林不保留;SCX柱中的二者均可保留。这是由于利巴韦林与金刚烷胺均为弱碱性化合物,需要与强阳离子交换柱结合净化。WCX为弱阳离子柱故无保留,而利巴韦林结构式中的共轭效应使其碱性弱于金刚烷胺,需要更强的阳离子交换柱SCX才能结合。同时,还尝试利用物理吸附作用考察了硅胶柱和氧化铝柱的净化效果。结果显示利巴韦林可在氧化铝柱中保留,金刚烷胺可在硅胶柱中部分保留,但二者无法在同一小柱上同步保留。综上,选用SCX作为固相萃取净化柱,可以实现两个组分的同步净化。
在离子交换柱中,碱性化合物通过离子交换得到H+从而结合在SCX固相萃取小柱上,可提供酸性环境使其中和呈分子态从而洗脱下来,也可提供更强的碱性环境通过竞争结合固定相使待测物进入洗脱液。比较了甲酸-水、氨水、乙腈、甲醇的洗脱效果。结果显示在SCX小柱上,甲醇即可实现对利巴韦林的洗脱,而金刚烷胺的洗脱需要碱性条件,最终选用5%氨化甲醇作洗脱液。
尝试常用的C18色谱柱对利巴韦林和金刚烷胺进行分离,发现其对利巴韦林基本无保留,利巴韦林直接在死时间出峰。亲水色谱(HILIC)是一种用来改善强极性物质在反相色谱中保留情况的色谱技术,通过采用强极性固定相,结合高比例有机相-低比例水相组成的流动相来实现分离。针对利巴韦林和金刚烷胺的极性分子特点,选择Waters UPLC BEH Hillic色谱柱(150 mm×2.1 mm, 1.7 μ m)。结果显示利巴韦林和金刚烷胺均可很好地分离。本实验也测试了HSS T3色谱柱,发现分离效果也较好,但质谱响应值只是BEH Hillic柱的1/30。
实验表明流动相水相中是否加入醋酸铵缓冲盐对结果无影响;而当流动相中的有机相由乙腈变为甲醇时,分析物响应值增高5倍,峰形变好。流速由0.3 mL/min 变为0.25 mL/min 时,分析物峰形变宽且有分叉。进样体积为3 μ L时峰窄但有锯齿,5 μ L时峰形较好,10 μ L时峰形无变化。 综上,选用甲醇-0.1%甲酸水作流动相体系,流速0.3 mL/min,进样体积5 μ L。
鸡肉中脂肪、蛋白质等杂质含量较多,如果在待测组分出峰后迅速将流动相组成降成初始流动相组成,虽能节省分析时间,但容易将蛋白质等大分子物质保留在色谱柱中,使色谱柱的使用寿命降低。因此,在利巴韦林出峰(1.45 min)后将流动相中甲醇的比例从20%线性增至80% ,冲洗色谱柱约0.9 min后再逐渐恢复至初始梯度,避免了长期使用时杂质在色谱柱中产生沉淀积累影响分离效果。
实验发现,当样品中利巴韦林含量相等时,定容溶液为甲醇-水时的响应值是纯水时的4倍,符合Hillic柱的工作原理。定容溶液中加入氨水可使金刚烷胺与利巴韦林的分离更好,因此样品经固相萃取净化浓缩后的定容溶液采用5%氨化甲醇。
ESI电离是将离子从溶液中转移至气相的过程,待测成分在溶液中成为离子状态可提高生成气相离子的效率,从而提高检测灵敏度。根据溶液化学的原理,利巴韦林和金刚烷胺在酸性条件下易结合质子形成正离子,因此选择正离子电离模式,并在流动相中加入甲酸以提供质子。质谱扫描中可见利巴韦林[M+Na]+峰信号较强,但考虑到结合稳定性,仍对[M+H] +峰进行扫描。
驻留时间(dwell time)影响检测的精确度和灵敏度。当驻留时间为0.1 s时,利巴韦林出峰呈锯齿状；增大驻留时间至0.202 s,得到的离子的准确度提高,重现性增加,峰形明显变好(见图2)。
分别配制利巴韦林和金刚烷胺的质量浓度为10.0、20.0、40.0、80.0、100.0 μ g/L 的系列混合标准溶液进行测定。以定量离子的峰面积对质量浓度进行线性回归计算,在10.0～100.0 μ g/L 范围内两种药物成分的线性关系良好(r2≥0.99)。取空白鸡肉样品，添加不同质量浓度的利巴韦林和金刚烷胺,前处理后由高至低检测直到信噪比等于10(S/N=10),确定鸡肉中利巴韦林和金刚烷胺的定量限为4.0 μ g/kg。
用鸡肉试样进行添加回收率和精密度试验。添加水平为4.0、8.0、20.0 μ g/kg,添加、混合后静置使标准溶液被样品充分吸收。然后按照本方法进行样品处理和测定,每个添加水平测定6次,结果见表2。其中添加水平为8.0 μ g/kg的空白鸡肉的MRM色谱图见图3。
将建立的方法应用于10份实际鸡肉样品的检测,检出其中1份含有10.8 μ g/kg 金刚烷胺,其他样品均未检出。
基于高效液相色谱-串联质谱技术,建立了一种快速、有效的鸡肉中利巴韦林和金刚烷胺的检测方法,获得了满意的分离效果和检测灵敏度。回收率、精密度和定量限均满足残留分析的要求。该方法尝试应用SCX净化和Hillic分离实现了利巴韦林和金刚烷胺的同时检测,与单组分检测相比节省了人力、时间和经济成本,提高了检测效率。
2013, Vol. 31 Issue (8): 724-728
PDF (831KB)
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