TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。溴化氰活化琼脂糖凝胶(CNBr-activated Sepharose 4B,北京拜耳迪生物技术有限公司),凝血酶(thrombin, T6884, 1 kU, Sigma),生色底物chromozym TH(Roche)。其他试剂均为分析纯,实验用水为娃哈哈纯净水。

凝血酶溶液的配制:取凝血酶1支(1 kU),加水稀释成10、40、100 U/mL的溶液,分装保存于-20 ℃冰箱中。

生色底物溶液的配制:精密称量5.0 mg chromozym TH,加入4 mL水溶解,分装保存于-20 ℃冰箱中。

缓冲溶液的配制:分别配制0.1 mol/L 的Na₂CO₃和NaHCO₃溶液(均含0.5 mol/L NaCl),用Na₂CO₃溶液滴定NaHCO₃溶液,调节其pH分别为7.8、8.3、9.0、10.0。

称取CNBr-activated Sepharose 4B浸于1 mol/L 盐酸中溶胀,并用1 mol/L HCl抽滤冲洗,按每1 g凝胶加入200 mL盐酸的量分批次冲洗凝胶。

分别取0.5、1、1.5、2、3 μ L凝血酶溶液(10 U/mL),加入缓冲溶液至340 μ L,混匀。于37 ℃温育2 min后加入10 μ L chromozym TH溶液,摇匀。再于37 ℃温育5 min后加入50 μ L 50%(体积分数)醋酸溶液终止反应,405 nm下测定吸光度。

将经预处理的CNBr-activated Sepharose 4B加入到pH 8.3的缓冲溶液中,再加入凝血酶溶液,混匀,反应过程中温和摇动反应液。每隔2 h测定一次吸光度,直到吸光度不再降低。测定方法为以400 r/min 的速率离心5 min后取上清液,于280 nm处测定。

称取CNBr-activated Sepharose 4B 400 mg,经盐酸预处理后均分为4等份,分别加入500 μ L pH 7.8、8.3、9.0、10.0的缓冲溶液。然后按照每1 g干凝胶加入100 U配基的比例加入凝血酶溶液,室温下振荡反应10 h。反应液以400 r/min 离心5 min,弃去上清液,下层凝胶用大量的pH 8.3的缓冲溶液反复清洗数次。将不同pH条件下偶联得到的凝胶转移至5 mL容量瓶中,用pH 8.3的缓冲溶液定容。摇匀后取出20 μ L加入320 μ L pH 8.3的缓冲溶液,按照1.4节进行生色底物反应,反应液离心后上清液在405 nm下测定吸光度。

称取CNBr-activated Sepharose 4B 500 mg,经盐酸预处理后,均分为5份,加入pH 8.3的缓冲液,按照每1 g干凝胶加入100、200、400、600、1000 U配基的比例加入凝血酶溶液,室温下振荡反应10 h。反应液按1.6节进行清洗、定容,并进行生色底物反应，测定吸光度。

按照1.6节方法在pH 8.3的缓冲溶液中制备凝血酶偶联琼脂糖色谱介质,但加酶量为200 U/g,最后用pH 8.3的缓冲溶液定容至5 mL, 于4 ℃保存。按生色底物法操作,每隔5天取出一部分测定凝血酶的活性,考察凝血酶偶联琼脂糖色谱介质的稳定性。

凝血酶与其底物chromozym TH反应生成的产物对硝基苯胺在405 nm处有吸收。在底物浓度过量情况下,405 nm处的吸光度应与凝血酶的用量成正比。实验中考察了凝血酶(10 U/mL)加入体积在0.5～5 μ L范围内变化时吸光度的变化情况。结果表明当凝血酶的加入量在0.5～3 μ L即5×10^-3～3×10^-2 U范围内时,吸光度随凝血酶的加入量线性增加。线性回归方程为Y=0.0148X-0.018, r²=0.9992,其中Y为吸光度,X为凝血酶加入量(U)。继续增大凝血酶的加入量至4～5 μ L时,吸光度值不再线性增加。

凝血酶与琼脂糖介质偶联后反应液离心,上清液中游离的凝血酶减少,280 nm处的吸光度(A₂₈₀)降低,完全反应后A₂₈₀不再改变,从而确定反应时间。实验中发现凝血酶与CNBr-activated Sepharose 4B偶联反应速度较快,0～4 h内吸光度迅速降低,反应6 h后吸光度值不再明显下降。为保证完全反应,反应时间适当延长至10 h。

偶联反应的pH值一方面影响凝血酶的活性,另一方面会影响偶联量及偶联位点等。实验中考察了pH 7.8～10.0之间变化对亲和色谱介质的影响,并用生色底物法测定了不同pH条件下色谱介质上凝血酶的活性。由图1可知,当pH为7.8、8.3和9.0时生色反应所测得的吸光度值无明显变化。这可能是由于凝血酶的活性范围是pH 5.0～10.0(最佳pH 8.3),在该pH范围内凝血酶活性基本不受影响;且反应结束后亲和色谱介质置于pH 8.3的缓冲液中,恢复了其最佳pH条件,因此测定的活性相差不大。而pH 10.0时凝血酶不稳定,即使反应后将pH恢复至最佳,凝血酶的活性也不再恢复。最终确定偶联反应的pH值为8.3。

图1

Fig. 1

图1 不同pH条件下制备的凝血酶亲和色谱介质对生色反应的影响 Fig.1 Effect of the thrombin coupled media prepared under different pH values on chromogenic reaction

配基用量是制备亲和色谱介质时的重要参数。酶用量过低时会造成偶联配基活力不足和色谱介质的浪费;酶用量过高可能造成偶联位点过多、偶联取向不合适或者形成空间位阻等,导致配基亲和能力降低或者配基的浪费。实验中考察了凝血酶用量在100～1000 U/g变化时,亲和色谱介质对生色反应的影响。所测定的吸光度值、凝血酶活性及凝血酶活性回收率见表1。当凝血酶用量从100 U/g增加到200 U/g时,吸光度及偶联凝血酶的活性显著增加;而从200 U/g增加到 1000 U/g时,吸光度及偶联凝血酶的活性也在逐渐增加,但增加趋势缓慢,而回收率却明显降低。可能是由于凝血酶用量较高时,由于反应位点不足、空间位阻等原因造成偶联凝血酶的活性增加缓慢,使大部分凝血酶未与色谱介质偶联,回收率降低。从实验结果看,凝血酶用量控制在200 U/g为合适,这与文献^{[ 12 ]}报道的151 U/g基本吻合。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 凝血酶用量对亲和色谱介质影响 Table 1 Effect of the quantity of thrombin on the affinity chromatography media Thrombin/(U/g) A405 Thrombin activity/(U/g) Recovery/% 100 0.179 33.3 33.3 200 0.289 51.9 25.9 400 0.327 58.3 14.6 600 0.334 59.5 9.9 1000 0.370 65.5 6.55

表1 凝血酶用量对亲和色谱介质影响 Table 1 Effect of the quantity of thrombin on the affinity chromatography media

在选定的最优条件下利用生色底物法测定偶联凝血酶色谱介质的稳定性,结果如图2所示。在测定的时间内,所测得的吸光度值逐渐降低,表明凝血酶的活性逐渐降低,但下降趋势比较缓慢。第40天时偶联琼脂糖凝胶上的凝血酶活性仍为最初制备时的70.6% 。有文献^{[ 15 ]}报道,凝血酶的水溶液在常温下24 h就会完全失活。将凝血酶偶联到琼脂糖凝胶后,凝血酶的稳定性得到很大提高,因此所合成的凝血酶亲和色谱介质可以在一定时间内反复使用。

图2

Fig. 2

图2 凝血酶亲和色谱介质稳定性考察 Fig.2 Stability of the thrombin coupled media