高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱法快速筛查和确证纺织品中禁用的偶氮染料


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云环 , 刘鑫, 王静, 严华, 崔凤云, 张朝晖

北京出入境检验检疫局技术中心, 北京 100026

收稿日期：2013-01-22

基金项目：国家质检总局科研项目(2010IK104, 2012IK145).

作者简介：

通讯作者：云环

摘要：建立了高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱(HPLC-LTQ/Orbitrap MS)快速筛查确证纺织品中禁用的偶氮染料的方法。样品在柠檬酸缓冲液中由连二亚硫酸钠还原成芳香胺, 经硅藻土提取柱净化后, 用Acquity UPLC BEH C18柱(50 mm× 2.1 mm, 1.7 μm)分离, 以甲醇和0.1%(v/v)甲酸作为流动相进行梯度洗脱, 电喷雾正离子(ESI+)模式电离, 高分辨质谱一级全扫描用于筛选分析, 数据依赖扫描模式的二级碰撞诱导解离(CID)谱图用于确证, 对纺织品样品中的偶氮染料进行定性鉴别。在0.05~2.00 mg/L范围内, 21种致癌芳香胺的线性相关系数均大于0.99。通过实际样品的加标回收测定, 回收率范围为65.5%~111.5%, 相对标准偏差(n=6)为0.87%~2.49%。该方法的定量限可以达到0.08 mg/kg, 可用于纺织品中禁用偶氮染料的实际检验工作。

关键词：高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱高分辨质谱禁用的偶氮染料致癌芳香胺纺织品

Rapid screening and confirming carcinogenic banned azo colorants in textiles by high performance liquid chromatography-linear ion trap/orbitrap high-resolution mass spectrometry

YUN Huan , LIU Xin, WANG Jing, YAN Hua, CUI Fengyun, ZHANG Zhaohui

Technology Center of Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026, China

Received: 2013-01-22

Abstract: A method of high performance liquid chromatography-linear ion trap/orbitrap high-resolution mass spectrometry (HPLC-LTQ/Orbitrap MS) was used to screen and confirm banned azo colorants in textiles rapidly. The analytes were reduced to carcinogenic aromatic amines with sodium dithionite in citrate buffer solution. The reduced solution was extracted by diatomite, and loaded onto an Acquity UPLC BEH C18 column (50 mm× 2.1 mm, 1.7 μm)with a gradient elution of methanol and 0.1%(v/v) methane acid aqueous solution, and finally detected by linear ion trap/orbitrap high-resolution mass spectrometry in positive ESI mode. In mass spectrometry method, the MS spectrum of high-resolution and the collision induced dissociation (CID) spectrum of data-dependent scan mode were used for screening analysis and conformation, respectively. The calibration curves showed a good linearity in the range of 0.05-2.00 mg/L, and the correlation coefficients (r) were higher than 0.99. By detecting spiked samples, the limits of quantification were 0.08 mg/kg for all the residues and the recoveries were in the range of 65.5%-111.5% with the relative standard deviations (RSDs) between 0.87% and 2.49%. The results indicate that the method is simple, rapid, sensitive and suitable for the qualitative and quantitative analysis of carcinogenic aromatic amines in textiles.

Key words: high performance liquid chromatography-linear ion trap/orbitrap high-resolution mass spectrometry (HPLC-LTQ/Orbitrap MS) banned azo colorants carcinogenic aromatic amines textiles

分子结构中含有偶氮基( － N = N － )的染料统称为偶氮染料, 其偶氮基常与一个或多个芳香环系统相连构成一个共轭体系而作为染料的发色体, 几乎分布于所有的颜色, 广泛用于纺织品、皮革制品等染色及印花工艺。研究表明, 用致癌芳香胺合成的偶氮染料受到人体肠道细菌以及偶氮还原酶的作用而易于发生偶氮还原裂解, 重新释放出致癌芳香胺, 从而产生致癌作用^{[ 1 ]}。德国、欧盟、日本及我国都明文规定:对于检测出禁用偶氮染料的纺织品一律禁止生产和销售。

传统的芳香胺检测方法, 如氧化显色法^{[ 2 ]}、重氮偶合法^{[ 3 ]}、纸色谱法^{[ 4 ]}、薄层色谱法^{[ 5 ]}、特定显色剂法^{[ 6 ]}等, 实验操作复杂, 对分析人员的技术要求比较高, 且常常受到样品量太小的限制而难以奏效。常见的仪器分析法有气相色谱-质谱联用法^{[ 7, 8, 9, 10, 11 ]}、液相色谱法^{[ 12 ]}、高效液相色谱-串联质谱法^{[ 13, 14 ]}。静电场轨道阱(orbitrap)高分辨质谱具有质量分辨率高和能提供精确相对分子质量的功能, 在全扫描模式下采集的数据可以根据检测需求反复调用, 由此弥补传统低分辨质谱方法无法应对法规更新频繁的不足; 其数据依赖性扫描(data-dependent scan)可以在筛查的同时, 通过碎片离子进行定性确证; 近年来其在食品检测、蛋白质组学^{[ 15, 16 ]}等方面已开始逐渐应用, 但在纺织品检测领域尚属空白。

本文建立了高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱(HPLC-LTQ/Orbitrap MS)快速筛查确证纺织品中禁用偶氮染料的方法。采用全扫描和正离子切换模式进行测定, 通过提取一级质谱的精确质量数进行定性和定量, 自动触发二级全扫描质谱进一步提高定性的准确性。该方法和现有文献报道方法相比更为快速、准确, 实际样品测定验证了其高灵敏度和可靠性, 结果令人满意。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

HPLC-LTQ-Orbitrap XL高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合质谱仪(美国Thermo公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司); 微孔滤膜(0.20 μ m, 美国Pall公司); 超声波清洗器(江苏昆山超声仪器有限公司); 小型高速离心机(德国Sigma公司); Chromabond XTR偶氮萃取柱(14.5 g/70 mL, 德国Macherey-Nagel公司)。

21种致癌芳香胺标准品(纯度大于98% , 德国Dr. Ehrenstorfer公司); 甲醇、叔丁基甲醚(色谱纯, 美国Fisher公司); 甲酸(色谱纯, 美国Tedia公司); 柠檬酸、氢氧化钠、连二亚硫酸钠(分析纯, 北京化学试剂公司); 实验用水均由Milli-Q超纯水系统制备。0.06 mol/L 柠檬酸盐缓冲溶液(pH 6):取12.526 g柠檬酸和6.320 g氢氧化钠溶于水, 定容至 1000 mL即得。21种致癌芳香胺的标准储备液用甲醇配制, 系列标准工作溶液用甲醇-水(2 ∶ 8, v/v)配制。

1.2 样品前处理

将样品剪成5 mm×5 mm小片, 称取1.0 g, 加入17 mL预热到(70±2) ℃的柠檬酸盐缓冲溶液, 振摇, 置于(70±2) ℃水浴中30 min; 加入3.0 mL 200 g/L 连二亚硫酸钠溶液, 置于(70±2) ℃水浴中30 min, 冷却至室温。提取液倒入硅藻土提取柱内, 吸附15 min。用80 mL叔丁基甲醚分4次反复洗提反应器中的试样, 合并入提取柱中。收集叔丁基甲醚提取液, 于35 ℃低真空下浓缩至1 mL, 再用氮气浓缩至近干。1 mL甲醇溶解并定容, 过0.2 μ m微孔滤膜, 滤液待测。

1.3 仪器条件

1.3.1 液相色谱条件

色谱柱:Acquity UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μ m; 美国Waters公司)。流动相A: 0.1%甲酸水溶液; 流动相B:甲醇。梯度洗脱程序: 0～5.0 min, 90%A～5%A; 5.0～7.0 min, 5%A; 7.0～7.1 min, 5%A～90%A; 7.1～8.0 min, 90%A。流速:0.25 mL/min; 柱温:35 ℃; 进样体积:5.0 μ L。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源; 毛细管温度350 ℃, 鞘气(N₂)流速为17 L/min(即30 arb), 辅助气(N₂)流速8 L/min(即10 arb); 在正离子模式下用Orbitrap检测器全扫描(full scan)和data-dependent scan模式检测; 全扫描的分辨率R=60000; data-dependent scan模式:当Event 1中的检测信号超过Parent List中化合物的设定阈值时, 自动触发Event 2; 二级质谱采用碰撞诱导解离(CID)方式产生碎片离子, 碰撞裂解气为高纯氦气, 碰撞能量为35% 。

2 结果与讨论

2.1 质谱电离条件的选择

CID电压是串联质谱中影响碎片离子强度的重要参数, 对检测灵敏度和特征离子碎片信息的丰度有直接影响。当CID电压较低时, 目标碎片离子峰强度较弱, 灵敏度相对较差; 当CID电压超过一定强度, 会产生过多的碎片离子而影响目标碎片离子的甄别。质谱条件优化结果为:CID电压在35%时, 21种芳香胺分别得到各自特征的碎片, 且分子离子峰和特征碎片离子峰的丰度比例相对稳定, 可以达到对待测物质的定性及定量要求。欧盟EC 2002/657^{[ 17 ]}规定:使用高分辨质谱时, 母离子识别点是2.0, 子离子识别点是2.5, 禁用物质的识别点是4.0。据此, 本实验通过一级母离子筛查和二级CID碎片离子确证对检测结果进行判定。21种致癌芳香胺的MS分析参数见表1。

表1 21种致癌芳香胺的HPLC-LTQ/Orbitrap MS分析参数 Table 1 HPLC-LTQ/Orbitrap MS analysis parameters of the 21 carcinogenic aromatic amines

2.2 液相色谱条件的优化

目前国内外测定偶氮染料的还原产物芳香胺时采用的流动相均为甲醇-磷酸缓冲盐体系, 但是使用缓冲盐体系时负载较大, 会极大地影响色谱柱的使用寿命, 而且磷酸盐为非挥发性酸, 易污染离子源, 与质谱仪不能兼容。将流动相由甲醇-磷酸缓冲盐体系改为甲醇-水体系后, 试验结果显示各物质的峰形不好。在实际的反相液相色谱工作中, 一般直接用酸或碱调节pH值来抑制弱解离化合物的离解。本实验在流动相的水相中加入甲酸, 采用梯度洗脱方式, 21种致癌芳香胺可以得到有效的分离。21种致癌芳香胺标准物质的总离子流(TIC)色谱图和CID质谱图见附图(http:/ /www.chrom-China.com/UserFiles/File/sp1301031-Fig.doc)。

2.3 样品的提取和净化

2.3.1 还原时间

禁用偶氮染料检测的原理为:染料在柠檬酸盐缓冲溶液介质中用连二亚硫酸钠还原分解, 检测其分解产物中的致癌芳香胺。偶氮染料是否还原充分直接影响检测结果:还原时间不够会降低偶氮染料的被还原程度, 致使检测结果偏低; 还原时间较长又会增加检测成本, 延长检测时间, 降低检测效率。本实验就还原时间对检测结果的影响进行了考察, 结果显示:对于棉质样品, 还原时间为10 min时偶氮染料还未完全还原; 还原时间延长至15 min时还原充分; 继续延长还原时间, 发现还原效果无明显改善。这是由于棉质样品易被充分浸透, 有利于还原反应的发生。但是对于涤纶等材质样品时, 还原时间为20 min才能充分还原。由于纺织品材质种类复杂, 染料种类也较多, 建议还原时间定为30 min以保证充分还原。

2.3.2 萃取试剂的选择

偶氮染料检测的常用萃取试剂为乙醚, 但乙醚储存过程中易产生过氧化物, 使用之前需通过硫酸亚铁溶液处理及蒸馏将其中的氧化物去除。该去除过程较为危险, 易引起爆炸。而叔丁基甲醚储存稳定, 不易生成过氧化物。本研究对未经过处理的乙醚、处理过的乙醚、叔丁基甲醚的萃取效果进行了对比, 结果显示:未经处理的乙醚的萃取效率约为处理过的乙醚的1/2; 处理过的乙醚和叔丁基甲醚效果相差无几, 但叔丁基甲醚作萃取剂的结果比乙醚作萃取剂的结果更为稳定。综合安全因素, 本研究选用叔丁基甲醚作为萃取剂。

2.4 线性范围、定量限、回收率和精密度

分别配制0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/L 的系列混合标准溶液进行测定, 以各致癌芳香胺的峰面积对其质量浓度进行线性回归, 在0.05～2.00 mg/L 范围内线性关系良好(r≥0.99)。在空白样品中进行加标试验, 前处理后按加标浓度由高至低检测, 以信噪比等于10(S/N=10)对应的浓度确定为定量限(LOQ)。本实验中, 在0.08 mg/kg 添加水平上, 所有21种致癌芳香胺的仪器信噪比均大于10, 确定该方法的LOQ可达到0.08 mg/kg。在棉、涤纶两种样品中添加21种致癌芳香胺的标准溶液, 添加水平分别为0.5、1.0和2.0 mg/kg, 每个添加水平平行测定6次, 回收率范围在65.5% ～111.5%之间, 相对标准偏差(RSD)为0.87% ～2.49%(见表2)。

表2 空白样品中3个加标水平的21种致癌芳香胺的回收率范围及相对标准偏差 Table 2 Recovery ranges and RSDs of the 21 carcinogenic aromatic amines at three spiked levels

2.5 方法的应用

将建立的方法应用于50份实际纺织品样品的检测, 从中检出2份样品含有对氯苯胺, 1份含有联苯胺和3, 3′-二氯联苯胺, 1份含有2-萘胺, 其余样品未检出。

3 结论

本文建立的纺织品中禁用偶氮染料的快速、高通量的高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱检测方法, 在8 min内完成了对21种致癌芳香胺的筛查和确证, 获得了满意的分离效果和检测灵敏度。方法的定量限满足国内外相关禁用偶氮染料的检测要求, 可作为一种快速筛查和确证检测技术广泛使用。

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[17]	Council Directive 96/23/EC

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... 从而产生致癌作用^{[ 1 ]} ...

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... 如氧化显色法^{[ 2 ]}、重氮偶合法^{[ 3 ]}、纸色谱法^{[ 4 ]}、薄层色谱法^{[ 5 ]}、特定显色剂法^{[ 6 ]}等 ...

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