Agilent 6890N-5975B气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司;IKA T-25高速分散器,德国IKA公司;RV10旋转蒸发仪,德国IKA公司;ZM200超离心研磨仪,德国Retsch公司。

甲醇、乙腈(色谱纯),德国默克公司;乙酸、丙酮、正己烷、乙酸钠、氯化钠、无水硫酸镁、无水硫酸钠(分析纯),国药集团;弗罗里硅土、硅胶、中性氧化铝、GCB、N-丙基乙二胺(PSA)、C₁₈吸附剂(分析纯),天津Agela Technologies。

1%乙酸-乙腈的配制:量取10.0 mL乙酸加入到 1000 mL容量瓶中,以乙腈定容并摇匀;盐析剂:无水硫酸镁和无水乙酸钠按照质量比4 ∶ 1混合;净化剂Ⅰ:无水硫酸镁、乙酸钠、PSA、C₁₈和GCB按照质量比6 ∶ 1 ∶ 2 ∶ 2 ∶ 2混合;净化剂Ⅱ:无水硫酸镁、乙酸钠、硅胶和GCB按照质量比9 ∶ 1 ∶ 9 ∶ 1混合;净化剂Ⅲ:无水硫酸镁、乙酸钠、中性氧化铝和GCB按照质量比9 ∶ 1 ∶ 9 ∶ 1混合。丁烯氟虫腈原药(纯度＞ 96.0% ,大连瑞泽农药股份有限公司)。

气相色谱条件:色谱柱为DB-5 MS毛细管(30 m×0.25 mm×0.25 μ m);载气为高纯氦气(99.999% );恒流模式,柱流速1.1 mL/min;进样量1 μ L,不分流进样;进样口温度270 ℃;柱温升温程序:初始温度70 ℃,保持1 min,以25 ℃/min 升至220 ℃,保持6 min,后运行温度280 ℃,保持6 min以去除色谱柱中残留杂质。

质谱条件:电子轰击离子源(EI源),电子轰击能量70 eV,单四极质量分析器;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;传输线温度280 ℃;全扫描(SCAN)模式:扫描范围m/z 50～500,确定待测化合物的扫描离子、保留时间和检查有无基质干扰;溶剂延迟9 min;选择离子模式(SIM):丁烯氟虫腈定量离子m/z 403,定性离子m/z 421、372、213;驻留时间:80 ms。

取适量丁烯氟虫腈用乙腈配成1.0 mg/L 的标准储备液,于-18 ℃冰箱中保存,使用前根据检测要求以空白基质提取液稀释成相应浓度的标准工作溶液。

取红茶、烘干包菜和烘干芹菜样品各约500 g研磨粉碎后装入洁净的容器中密封备用,于-18 ℃下冷藏保存。

称取样品2.00 g于50 mL具塞离心管中,加入饱和氯化钠溶液2.0 mL,适当振荡后静置15 min,之后依次加入3.0 g净化剂Ⅲ和1%乙酸-乙腈提取液10.0 mL,以 10000 r/min 的转速匀浆1.0 min,另取1%乙酸-乙腈10.0 mL清洗刀头,合并溶液,以 4000 r/min 转速离心5 min,将全部溶液倾入50 mL心形瓶中并在40 ℃下旋转蒸发近干,加入2.00 mL 1%乙酸-乙腈定容,经0.22 μ m滤膜过滤,待分析。

取各质量浓度水平的基质匹配标准溶液,以峰面积和质量浓度绘制工作曲线。将处理后的样品溶液进行分析,以选择离子扫描(SIM)采集数据,外标法测定样品中丁烯氟虫腈残留量。

取丁烯氟虫腈标准液(1.00 mg/L)在m/z 50～500质量范围内进行全扫描,其总离子流色谱图和质谱图见图1。

图1

Fig. 1

图1 丁烯氟虫腈标准品的总离子流色谱图及质谱图 Fig.1 Total ion chromatogram (TIC) and mass spectrum of butene-fipronil standard

由于丁烯氟虫腈分子中含有两个氯原子,其分子离子峰m/z 490理论上应有两个同位素峰m/z 492、m/z 494,此3个同位素峰经同样裂解途径应该产生对应的3个同位素峰簇。在质谱图高质量端未发现有明显分子离子峰,但质谱图上主要裂解离子簇m/z 403、405、407,m/z 421、423、425和m/z 213、215、217均以同位素峰簇形式呈现,由此可以推断它们为分子离子峰及其同位素峰经过相同方式裂解的相应产物。

当丁烯氟虫腈分子氧原子上的n电子丢失时,产生奇电子离子,之后发生的裂解有3条途径。第一种途径为分子离子氢重排反应(rH)后经i断裂生成碎片离子m/z 372;第二种途径为分子离子的游离基中心诱导发生 α 断裂产生碎片离子m/z 421,该离子又经i断裂产生碎片离子m/z 213;第三种途径为分子离子氢重排反应后经取代反应(rd)产生碎片离子m/z 421,该离子共振后发生消去反应(re)产生碎片基峰离子m/z 403。断裂过程及机理见图2。由于在m/z低于100的低质量端碎片离子峰易受到进样溶剂、样品中的杂质和色谱柱的流失等因素干扰,不易判别,不作为定性和定量离子用,因此选择m/z 403作为定量离子,同时选择m/z 421、372、213作为定性离子。

为了验证MASP方法的可行性并优化前处理条件,在10 μ g/kg 添加水平下进行回收试验,以基质复杂、色素含量较高的红茶为考察样品,在优选吸附剂种类并固定提取溶剂用量的前提下,综合考察以下4个因素:提取方法:振荡萃取30 min、超声提取15 min,高速匀浆提取1 min;提取溶剂种类:1%乙酸-乙腈、乙酸乙酯、正己烷/丙酮(2 ∶ 1,v/v);净化剂种类:I、Ⅱ、Ⅲ;净化剂用量:1.0 g、2.0 g和3.0 g。设计正交试验方案以优化前处理条件^{[ 22 ]},其中每个试验均进行3个加标样品的测试,所得到的回收率结果见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 丁烯氟虫腈的正交试验结果(n=3) Table 1 Orthogonal test results of butene-fipronil (n=3) Pretreatment conditions(①+②+③+④) Added/( μ g/kg) Recovery/% RSD/% OE+1%AAA+Ⅰ+A 10 88.7 2.8 OE+EA+Ⅱ+B 10 82.3 2.7 OE+HA+Ⅲ+C 10 74.8 3.2 UAE+1%AAA+Ⅱ+B 10 85.4 3.1 UAE+EA+Ⅲ+A 10 81.2 2.4 UAE+HA+Ⅰ+C 10 78.9 2.8 HSHE+1%AAA+Ⅲ+C 10 98.2 3.0 HSHE+EA+Ⅰ+B 10 84.7 2.5 HSHE+HA+Ⅱ+A 10 92.5 2.9 ① Extraction method: OE, oscillation extraction; UAE, ultrasonic assisted extraction; HSHE, high-speed homogenate extraction. ② Extraction solvent: 1%AAA, 1% acetic acid-acetonitrile; EA, ethyl acetate; HA, hexane/acetone (1 ∶ 1, v/v). ③Purifying agent: Ⅰ, MgSO4-NaOAc-PSA-C18-GCB (mass ratio of 6 ∶ 1 ∶ 2 ∶ 2 ∶ 2); Ⅱ, MgSO4-NaOAc-silica gel-GCB (mass ratio of 9 ∶ 1 ∶ 9 ∶ 1); Ⅲ, MgSO4-NaOAc-neutral alumina-GCB (mass ratio of 9 ∶ 1 ∶ 9 ∶ 1). ④ Purifying agent dose: A, 1.0 g; B, 2.0 g; C, 3.0 g.

表1 丁烯氟虫腈的正交试验结果(n=3) Table 1 Orthogonal test results of butene-fipronil (n=3)

图2

Fig. 2

图2 推断的丁烯氟虫腈特征碎片离子裂解机理 Fig.2 Inferred cleavage mechanism of butene-fipronil characteristic fragment ions

对实验结果进行直观、极差和方差分析,综合比较提取效率,发现高速匀浆提取、1%乙酸-乙腈、净化剂Ⅲ和3.0 g净化剂的组合回收率相对较高,最后得到的定容液颜色清亮,有较好的净化效果。图3是在优化的前处理条件下加标样品净化后的总离子流图,从图3可见目标峰附近无杂质峰干扰,并且实现了基线分离,表明所确定的前处理条件有较好的分离和净化效果。

图3

Fig. 3

图3 丁烯氟虫腈标准品、茶叶空白样品及加标样品的TIC图 Fig.3 TIC chromatograms of butene-fipronil standard, blank sample and spiked sample of tea

为了综合考察MASP与传统的固相萃取(SPE)法和QuEChERS方法的前处理效果,依照2.2节中所确定的提取剂和净化剂种类,以烘干包菜为考察样品,在50 μ g/kg 添加水平下进行回收试验对MASP方法与固相萃取法(SPE)、QuEChERS方法的前处理效果进行比较。其中固相萃取法的前处理条件为:加标样品参照1.4节的称量、提取和离心步骤进行处理,称取1.0 g净化剂Ⅲ填装固相萃取小柱并将提取液浓缩后上样,用正己烷/丙酮(体积比2 ∶ 1)10 mL洗脱,收集所有洗脱液浓缩并定容分析;QuEChERS方法的前处理条件为:加标样品按1.4节所述的称量、提取(加入盐析剂2.0 g,并加入1%乙酸-乙腈提取液10.0 mL)和离心步骤进行处理,在5 mL离心管中称取0.5 g的MgSO₄、PSA和GCB混合物(质量比3 ∶ 2 ∶ 1),加入1.0 mL提取液,涡旋离心后过滤分析。

试验结果如表2所示。从表2中可以看出,SPE方法与MASP方法回收率相近,均取得了较好的回收率效果,但相对而言SPE方法的前处理过程更加费时费溶剂;QuEChERS方法与MASP方法相比,QuEChERS方法回收率过高,表明其具有明显的基质增强效应。其原因可能是QuEChERS方法净化效果不佳,样品中的某些内源性物质电离所产生的离子碎片与待测物的碎片相同,从而产生增强效应;同时也可能是QuEChERS方法中仅吸取1.0 mL提取液用于净化,而净化的吸附剂用量通常为0.3～0.5 g^{[ 15, 16, 17, 18, 19 ]},相对1.0 mL提取液而言吸附剂的量较大,吸附剂可能会选择性地吸附一定量的溶剂,客观上对提取液起到了浓缩作用,从而造成回收率的升高。当前,对于基质效应的原理尚不明确,消除方法也需要进一步研究。总体而言,与SPE方法和QuEChERS方法相比,MASP方法具有更高的样品前处理效率和无明显基质增强效应的特点。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 3种前处理方法的回收率试验结果(n=3) Table 2 Results of recovery test of the three pretreatment methods (n=3) Pretreatment method Added/( μ g/kg) Recovery/% RSD/% SPE 50 92.1 2.9 QuEChERS 50 126.8 3.2 MASP 50 95.8 2.6 SPE: solid phase extraction; QuEChERS: quick, easy, cheap, effective, rugged and safe; MASP: multiple adsorption synchronous purification.

表2 3种前处理方法的回收率试验结果(n=3) Table 2 Results of recovery test of the three pretreatment methods (n=3)

取一系列不同浓度的茶叶基质标准溶液,在本方法所确定的分析条件下进行分析,以峰面积(y)对丁烯氟虫腈的质量浓度(x, μ g/L)进行线性回归。结果表明:丁烯氟虫腈在2～100 μ g/L范围内有良好的线性关系,丁烯氟虫腈的回归方程为y=1296x-765.9,相关系数r²=0.9999。以样品加标回收的方式测定方法的检出限(S/N=3)为2 μ g/kg,定量限(S/N=10)为6 μ g/kg。

分别称取空白红茶、烘干包菜和烘干芹菜样品,在检出限、定量限以及5倍检出限3个浓度水平进行加标,加标样品适当涡旋并振荡后放置于通风橱中老化2 h后制得浓度为2、6、10 μ g/kg 的3个添加水平加标样品,每个水平6个平行样品,并按照1.4节和1.5节进行回收率和精密度试验,结果见表3。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 丁烯氟虫腈的回收率与相对标准偏差(n=6) Table 3 Recoveries and RSDs of butene-fipronil (n=6) Sample Added/( μ g/kg) Recovery/% RSD/% Black tea 2 92.2 4.8 6 96.1 2.7 10 97.1 2.9 Dry cabbage 2 92.3 5.2 6 96.0 2.7 10 97.5 2.8 Dry celery 2 91.8 4.8 6 96.5 3.2 10 97.8 2.7

表3 丁烯氟虫腈的回收率与相对标准偏差(n=6) Table 3 Recoveries and RSDs of butene-fipronil (n=6)

由于质谱在电离和扫描过程中存在基质效应的影响,通常需采用基质匹配的标准溶液来补偿基质 效应。为了考察基质效应的影响,取50 μ g/L的标准溶液配制基质标样,与同等浓度的溶剂标准溶液进行对比测定,依照公式 η =(A_i)_基质标样/(A_i)_溶液标样(A_i为丁烯氟虫腈的峰面积)计算基质效应^{[ 23 ]}。实验结果表明,3种基质的 η 在0.98～1.06之间,数值接近1,表明基质效应不明显,说明以上基质经过本方法净化后对质谱检测不产生显著影响。