色谱    2013, Vol. 31 Issue (9): 850-861     PDF (2145KB)       
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朱永哲
冯雅男
金正汉
超高效液相色谱-串联质谱法同时测定土壤中239种农药的残留量
朱永哲1 , 冯雅男1, 金正汉2       
1. 青岛农业大学化学与药学院, 青岛 266109;
2. 首尔大学农业与生命科学学院, 首尔 151742, 韩国
收稿日期：2013-01-25
基金项目：青岛市公共领域科技支撑计划项目(11-2-3-55-nsh); 青岛农业大学高层次人才基金(630608).
作者简介：
通讯作者：朱永哲
摘要：建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS), 可于10 min内快速测定土壤中的239种农药残留。土壤样品经AOAC (Association of Official Analytical Chemists) QuEChERS方法处理, 用乙腈萃取; 无水硫酸镁、乙酸钠固液分离后, 过0.2 μm滤膜; 在UPLC-MS/MS正、负离子同步扫描多反应监测模式下进行分析。239种农药中, 线性相关系数(r2)大于0.99的有236个, 占总数的99%。在40 μg/kg添加水平下所有被检测农药的回收率均在50%~150%之间, 且相对标准偏差(RSD)均小于20%; 其中有209种农药的回收率达到70%~120%, 有161种的RSD小于10%。方法的检出限(LOD)范围为0.69~29.04 μg/kg。土壤中多种农药残留的同时检测要求时间短、准确度和精密度高, 本方法符合这些检测要求, 适用于土壤中农药残留的检测。
关键词： QuEChERS        超高效液相色谱-串联质谱法        农药        多残留        土壤       
Determination of 239 pesticide residues in soil by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
ZHU Yongzhe1 , FENG Yanan1, KIM Jeonghan2       
1. College of Chemistry and Pharmacy, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China;
2. Department of Agricultural Biotechnology, Seoul National University, Seoul 151742, Korea
Received: 2013-01-25
Abstract: A method for the determination of 239 pesticides in soil samples by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) is presented. The sample was prepared with AOAC (Association of Official Analytical Chemists) QuEChERS method for the extraction (acetonitrile, anhydrous MgSO4, CH3COONa). After filtered with a 0.2 μm membrane, the sample was separated and detected by UPLC-MS/MS performing on positive/negative electrospray ionization (ESI+/-) and the multiple reaction monitoring (MRM) mode. In this study, 236 of the 239 pesticides' correlation coefficients were above 0.99, which counted 99% of all the analytes. The limits of detection (LODs) ranged in 0.69-29.04 μg/kg (S/N=3). The recoveries of all the pesticides at 40 μg/kg spiked level were in the range of 50%-150%, and the relative standard deviations (RSDs) were below 20%. In addition, the recoveries of 209 pesticides were in the range of 70%-120%, and RSDs of 161 pesticides were less than 10%. The method is efficient, fast, simple, and accurate. The procedure is suitable for the determination of multi pesticide residues in soil.
Key words: QuEChERS        ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)        pesticides        multi-residues        soil       
粮食作物等食品在全球范围内的需求日益增加, 为提高产量, 农药的使用越来越广泛[ 1 ]。然而农药是环境中最危险的污染物之一, 过度使用和滥用对环境和人类健康都会造成很大的不利影响。农药施用不当, 其残留物会进入到土壤、空气、地表水和地下水, 甚至进入食物链从而对整个生态系统造成破坏[ 2 ]。因此, 在环境质量评估中, 土壤中的农药残留分析已成为不可或缺的一部分。

对样品进行分析时, 由于分析物的化学性质不同、基质复杂、分析浓度较低, 必须对样品进行前处理[ 3 ]。而耕地土壤成分复杂, 用药史不确定性高, 所以确定土壤前处理的方法更加重要。近几年, 大量农药残留分析的样品前处理趋于简单化和环境友好, QuEChERS方法[ 4, 5 ]是一种快速、简单、廉价、高效、耐用、安全的样品前处理方法, 在水稻[ 6 ]、水果[ 7, 8, 9, 10, 11, 12 ]、蔬菜[8, 11-13]、茶叶[ 14 ]等食品安全领域得到了广泛的应用。也有一些利用QuEChERS检测土壤中农药残留的报道, 比如Lesueur等[ 1 ]采用QuEChERS-HPLC-MS/MS测定土壤中24种农药的残留, 平均回收率为72.7% ; Caldas等[ 15 ]用LC-Atmosphere Pressure Chemical Ionization (APCI)-MS/MS测定水稻田土壤中5种农药的残留, 回收率为70.3% ～120% , 相对标准偏差均小于18.2% ; Dro d yński等[ 16 ]用UPLC-MS/MS测定土壤中4种杀虫剂的残留, 回收率在67% ～108%之间, 相对标准偏差小于12% ; 梅梅等[ 17 ]用QuEChERS方法测定土壤中5种除草剂的残留量, 在4和40 μ g/kg 水平下平均加标回收率为75.4% ～98.5% , 相对标准偏差为3.2% ～11.8% 。但未见测定土壤中几百种农药的相关报道。

耕地土壤经过多种作物的种植后, 用药史复杂且难以确定, 这使得耕地土壤中含有的农药极为复杂。当样品中含有的农药有上百种甚至更多时, 分组测试消耗时间多, 且浪费大量试剂。本研究拟采用AOAC (Association of Official Analytical Chemists) QuEChERS[ 5 ]方法对土壤样品进行前处理, 不经过净化过程, 对239种极性不同的农药同时分析, 利用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)检测, 确立短时间内检测其残留的方法。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

UPLC-MS/MS 8030液相色谱-质谱联用仪, 配有电喷雾离子源(日本Shimadzu公司); HM-200电子天平(日本A&D公司); Combi 408离心机和Micro 17TR高速离心机(韩国Hanil公司); Laborota 4000旋转蒸发仪(德国Heidolph公司); Reacti-Thermo干式加热氮气吹干仪(美国Thermo公司); Labostar 7 TWF-UV超纯水机(德国Siemens公司); Branson 5510超声波清洗机(美国Branson公司); Vortex-2涡旋混合器(美国Scientific公司)。

丙酮、乙腈、甲醇(色谱纯, 美国Honeywell公司); 甲酸、甲酸铵(色谱纯, 德国Fluka公司); AOAC QuEChERS萃取盐(6 g无水硫酸镁, 1.5 g乙酸钠, 美国安捷伦公司)。239种农药(见表1)标准品购于德国Dr. Ehrenstorfer公司、美国Chem service公司、德国Fluka公司等。

表1 UPLC-MS/MS分析239种农药的质谱参数、检出限以及基质效应 Table 1 The MS parameters, limits of detection (LODs) and matrix effects of the 239 pesticides analyzed by UPLC-MS/MS

土壤样品采于青岛农业大学校内试验田, 常温条件下自然风干10个月后, 过20目筛储存, 用作土壤空白样品。

1.2 农药标准溶液的配制

单一农药标准液:准确称取5 mg (精确至0.1 mg)各农药标准品, 分别根据各自的溶解度选用甲醇、丙酮、乙腈等溶剂定容至5 mL, 得到239种农药的单一农药标准储备液(1000 mg/L), 于-18 ℃避光密封储存。再用甲醇分别稀释单一农药标准储备液, 得到100、10、5和1 mg/L 的农药工作液各10 mL, 于-4 ℃储存, 用于对农药质谱条件的优化和混合农药标准液的配制。

混合农药标准液:量取100 mg/L 的农药标准液各3 mL, 依次添加、蒸干后用甲醇定容为30 mL, 得到10 mg/L 的混合农药标准储备液, 于-18 ℃避光密封储存。

基质混合农药标准液:用土壤空白提取液配制200, 100, 50, 20, 10, 5, 1 μ g/L 的系列浓度基质混合标准液, 用于基质标准曲线的测定。

1.3 样品前处理

称取5 g土壤样品, 置于50 mL离心管中, 依次加入水(5 mL)、乙腈(10 mL)、AOAC QuEChERS萃取盐包, 剧烈振荡2 min后用冰冷却, 离心(3500 r/min, 5 min)。吸取400 μ L上清液, 加入含0.5%(如无特殊说明均为体积分数)甲酸的100 μ L乙腈, 过0.2 μ m滤膜后待测。

1.4 UPLC-MS/MS条件
1.4.1 UPLC条件

Phenomenex Kinetex C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μ m); 流动相A为水溶液(含5 mmol/L 甲酸铵, 0.1%甲酸), B为甲醇溶液(含5 mmol/L 甲酸铵, 0.1%甲酸); 流速0.5 mL/min; 柱温40 ℃; 进样体积10 μ L。线性梯度洗脱程序:0～0.5 min, 0%B; 0.5～1 min, 0%B～55%B; 1～8 min, 55%B～95%B; 8～10 min, 95%B; 10～15 min, 0%B。

1.4.2 MS条件

电喷雾离子源(ESI); 正、负离子扫描方式; 多反应监测(MRM); 接口电压:4.5 kV; 雾化气体流速:3 L/min; 雾化温度:400 ℃; 脱溶剂气体流速:15 L/min; 脱溶剂温度:250 ℃; 碰撞诱导电离气体压力:230 kPa。各个农药的质谱采集参数(母离子、碎片离子、Q1电压、碰撞能量、Q3电压)见表1。

2 结果与讨论
2.1 MS条件优化

分别取10 μ L的239种农药标准液(1 mg/L), 在流动相存在的条件下进入离子源, 在正、负离子扫描同时检测模式下对各农药进行一级质谱分析(全扫描模式), 得到农药母离子; 对各农药母离子进行二级质谱分析(碎片离子扫描), 确定碎片离子, 并优化各农药的Q1电压、碰撞能量、Q3电压等参数, 结果见表1。

2.2 UPLC条件优化
2.2.1 液相色谱柱的选择

分析几百种农药时, 尤其是分析物极性差异较大时, 大粒径和大内径的色谱柱对农药的分离度不够理想[ 18 ]。实验中选用Phenomenex Kinetex C18 (100 mm×2.1 mm, 2.6 μ m)和Phenomenex Kinetex XB-C18 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μ m)2种小粒径色谱柱进行比较, 对100 μ g/L 的混合农药标准液进行UPLC-MS/MS分析。这2种色谱柱均可在10 min之内完成239种农药的分离检测。分析2种色谱柱条件下的总离子流图(见图1), 粒径为2.6 μ m的色谱柱可以使混合农药更好的分离, 灵敏度更高。

图1 不同色谱柱条件下UPLC-MS/MS方法分析混合农药标准液(100 μ g/kg)的总离子流图 Fig.1 Total ion chromatograms of mixed standard pesticides (100 μ g/kg) with two different columns by UPLC-MS/MS crassispina a. Phenomenex Kinetex C18 column (100 mm×2.1 mm, 2.6 μ m); b. Phenomenex Kinetex XB-C18 column (100 mm×2.1 mm, 1.7 μ m).
2.2.2 流动相梯度的选择

农药多残留分析中, 流动相梯度不同, 保留时间、峰形和灵敏度都会改变。选择流动相流速时, 发现出峰时间较早的乙酰甲胺磷(100 μ g/L)有拖尾现象, 所以选择乙酰甲胺磷为代表, 优化流动相梯度(见表2)。采用梯度4时, 乙酰甲胺磷的峰形和灵敏度最好(见图2)。用梯度4在优化的色谱-质谱条件下, 对100 μ g/L 的混合农药标准液进行分析, 10 min内239种农药完全分离, 且峰形尖锐, 检测效率较高。各农药的保留时间见表1。

表2 用于优化的4种流动相洗脱梯度 Table 2 Four kinds of mobile phase gradient used for optimization

图2 不同流动相梯度下乙酰甲胺磷的UPLC-MS/MS色谱图 Fig.2 Chromatograms of acephate with four mobile phase gradients analysed by UPLC-MS/MS a. Gradient 1; b. Gradient 2; c. Gradient 3; d. Gradient 4. For gradients, see Table 2.
2.3 方法的线性关系和检出限

用甲醇配制1、5、10、20、50、100、200 μ g/L 的混合标准液, 以各组分峰面积(y)对质量浓度(x, μ g/L)绘制标准曲线。239种农药在1～200 μ g/L 范围内线性关系良好, 除去灭草松(r2=0.9889)、氯氟吡氧乙酸(r2=0.9878)、敌百虫(r2=0.9871)外, 其他236种农药的相关系数(r2)均在 0.9911～1.000。且混合标准液中各个农药的峰形、峰面积与单一农药标准液的峰形、峰面积相差不多, 说明多种农药混合后稳定性良好。按照3倍信噪比(S/N=3)计算土壤中农药的检出限为0.69～29.04 μ g/kg(见表1)。

2.4 基质效应

基质的存在可能增强或抑制离子强度。不仅样品基质、化合物本身对离子强度有影响, 分析时溶液的浓度也会产生影响。称取土壤样品按照1.3节方法处理, 上述条件下检测提取液未发现样品中含有农药。然后用土壤空白样品提取液配制得到1、5、10、20、50、100和200 μ g/L 的基质混合标准液, 以各组分峰面积(y)对质量浓度(x, μ g/L)绘制标准曲线。当平均基质效应(ME, 增强或抑制)大于20%时, 认为基质效应对定量检测有显著影响, 不可忽略。基质效应可以通过方程(1)计算:

ME= Sm Ss -1 ×100% (1)


式中Sm为基质标准曲线的斜率, Ss为溶剂标准曲线的斜率。

按1.3节方法对土壤样品进行提取, 其中111种农药的基质效应小于20% , 对137种农药产生增强效应, 仅对乙氧喹啉产生了抑制作用(见表1)。所以在进行加标回收率计算时, 采用基质标准曲线进行计算, 以减小基质效应对结果的影响。

2.5 方法的准确度和精确度

方法的准确度和精确度通常用加标样品的回收率和重复实验的相对标准偏差来表达。被分析物较少时, 样品回收率在70% ～120% , 相对标准偏差(RSD)小于20%时实验方法是可行的。在本研究中, 向空白土壤中添加8和40 μ g/kg 水平的239种农药混合标准液, 每个水平重复测定3次, 按照1.3节的方法进行提取, 得到的各农药的添加回收率和相对标准偏差见表3, 相关数据的柱状图见图3。结果表明, 添加水平为8 μ g/kg 时有138种农药回收率在70% ～120%内, 占总数的58% ; 其中75种RSD小于10% , 131种RSD小于20% 。添加水平为40 μ g/kg 添加水平时, 有209种的回收率在70% ～120%范围内, 占总数的87% ; 其中RSD小于10%的有141种, RSD小于20%的有209种。

图3 UPLC-MS/MS测定不同添加水平下的各回收率范围的农药个数占总数的百分数 Fig.3 Percentages of the pesticides in total pesticides within each recovery range at different spiked levels analysed by UPLC-MS/MS Numbers of the pesticides of each recovery range are depicted above the bars. Peaks

根据国际农药残留检测标准指导, 当被分析的农药达到几百种时, 回收率在50% ～150%范围内, RSD小于20%的方法是可行的[ 11, 19 ]。我们分析了 回收率在50% ～150%范围内的结果, 添加水平为 8

表3 土壤中农药平均回收率和相对标准偏差(n=3) Table 3 Average recoveries and relative standard deviations (RSD) of the pesticides in soil (n=3)
μ g/kg 时, 222种农药符合标准, 其中RSD小于10%的有121种, RSD大于10%但小于20%的有214种; 添加水平为40 μ g/kg 时, 所有检测农药均符合标准, 其中RSD小于10%的有161种, RSD大于10%但小于20%的有239种。

当多种极性不同的农药混合在一起时会互相影响, 降低灵敏度。本研究在8和40 μ g/kg 的添加水平上, 239种农药均获得了了较好的分析结果。相对之前的研究[1, 15, 16, 20], 添加浓度较低。近年来, 农药残留限量越来越低, 该研究方法可以达到检测低水平多农药残留的要求。

3 结论

本文建立了一种基于QuEChERS-UPLC-MS/MS的方法, 可在10 min内同时测定土壤中的239种农药残留量。选取了8和40 μ g/kg 的加标水平进行回收率试验, 结果表明该方法的准确度和精确度良好。本方法满足土壤中多残留农药检测要求, 而且高效、快速、简单、灵敏度高、确认性和实用性强, 可作为土壤中多残留农药检测的常规方法。

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