利巴韦林(ribavirin)是一种广谱抗病毒核苷酸类化合物,能抑制多种核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)病毒引起的疾病,临床主要用于人类病毒性感冒、腺病毒、肺炎、麻疹、甲型肝炎及病毒性脑炎等疾病的治疗[ 1 ]。养殖户为了提高肉鸡的抵抗力,缩短养殖周期,违规将人类抗病毒药物利巴韦林移植兽药用,这种非治疗目的的长期用药易使肉鸡产生抗药性。同时因利巴韦林具有较强的致畸效应,鸡肉及其制品中的药物残留还可通过食物链危害人体心脏、肾脏等脏器。为了保护消费者的利益,我国农业部第560号公告(2005)禁止将利巴韦林等抗病毒药物用于畜牧生产过程。在当今的食品安全背景下,建立一种有效检测利巴韦林残留量的方法具有非常重要的现实意义。
利巴韦林在生物体内易代谢为磷酸化利巴韦林(≥50% )[ 2 ],目前有关利巴韦林及其代谢物的测定方法主要有分光光度法及液相色谱法。采用分光光度法测定药物含量时,通过添加无机试剂,使药物氧化产生有色物质进行分析[ 2, 3 ];液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)在207～235 nm波长下常用于测定药物、血液、血浆中利巴韦林的含量[ 4, 5, 6, 7 ];为了提高分析灵敏度,液相色谱-质谱联用技术开始用于脑组织[ 8 ]、肝脏[ 1, 9 ]、血清[ 10 ]、血浆[ 11, 12 ]、细胞[ 13, 14 ]中微量利巴韦林及其代谢物残留量的分析;但以上研究均采用反相色谱技术测定强极性化合物利巴韦林,并且主要应用于药物临床分析中。朱永林等[ 1 ]报道了反相色谱技术测定鸡肝中利巴韦林总残留量的分析方法,方法采用苯硼酸固相萃取净化,但该方法操作繁琐。据文献[ 9, 13, 14 ]报道，在酸性磷酸酶作用下,磷酸化利巴韦林代谢物可完全转化为利巴韦林原药。因此,本实验先采用酸性磷酸酶解离代谢物,然后测定利巴韦林的总残留量。为了解决利巴韦林色谱保留性差的难题,本方法联合采用亲水作用色谱-质谱测定技术与简单的固相分散萃取净化技术,建立了一种快速、灵敏测定鸡肉及其制品中利巴韦林及其代谢物总残留量的确证方法。
API 4000Q液相色谱-串联线性离子阱质谱联用仪(美国AB公司,配Waters超高效液相色谱仪和电喷雾离子源); T18涡旋混匀器(德国IKA公司); 8210型水浴超声波装置(日本Yamato公司);日立5810型离心机(日本Hitachi公司); OA-SYS氮气浓缩仪(美国Organomation公司)。利巴韦林标准品(纯度为99% )购自美国Sigma-Aldrich公司,C18键合相填料与PSA粉(美国Agilent公司);甲酸(纯度96% )和乙腈(色谱纯,美国Fisher公司);酸性磷酸酶(爱尔兰Megazyme公司,200 U/mL),其他试剂均为分析纯;水为Millipore纯水系统制得的高纯水(≥18 M Ω ·cm)。
待测生鸡肉样品来源于实验室送检的样品,煎炸熟鸡肉样品为市售鸡肉制品。
分别称取按质量折算为100%的标准品10 mg于100 mL容量瓶中,加入甲醇溶解并定容至刻度,该标准储备液的质量浓度为100 mg/L。取标准储备液用乙腈-0.1%甲酸水溶液(1 ∶ 1, v/v)稀释为质量浓度为1.0 mg/L 的质谱调谐溶液。取标准储备液用乙腈配制成质量浓度为1.0 mg/L 的中间标准工作溶液。
色谱柱:Waters Amide (100 mm×2.1 mm, 1.7 μ m)。柱温:30 ℃。流动相:A,乙腈;B, 0.1%甲酸溶液。洗脱梯度程序:0 min (80%A),保持1 min; 1～2.5 min (80%A～10%A),保持2.5 min; 5～5.1 min (10%A～80%A),保持3 min。流速:0.3 mL/min;进样量:10 μ L。
电喷雾离子化方式下正离子电离(ESI+);雾化气压力:379 kPa(55 psi);气帘气压力:172 kPa(25 psi);喷雾电压:5500 V;去溶剂温度:550 ℃;去溶剂气压力:345 kPa(50 psi);碰撞气压力:69 kPa(8 psi);多反应监测(MRM)模式;检测离子对:m/z 245.2/113.1(定量,碰撞能量(CE)为15 eV)、m/z 245.2/96.1(定性,CE为43 eV);离子对驻留时间:50 ms;去簇电压(DP): 50 V;碰撞室出口电压(CXP): 12.5 V;射入电压(EP): 10 V。
称取5.0 g样品置于50 mL离心管中,加入20 mL 含1%(v/v)乙酸的乙腈和50 μ L酸性磷酸酶,涡旋混匀3 min,超声10 min,于37 ℃酶解60 min,取出后以 4000 r/min 离心5 min,转移上清液,再加入5 mL 含1%(v/v)乙酸的乙腈于样品残渣中,涡旋混匀后离心,合并上清液并定容至30 mL。加入10 mL乙腈饱和的正己烷,液液分配后离心,弃去正己烷层,再加入10 mL乙腈饱和的正己烷重复液液萃取操作。吸取6 mL样液加至0.5 g C18与0.5 g PSA中,涡旋混匀3 min,静置5 min使样液与填料充分接触,以 4000 r/min 离心2 min,转移上清液于另一试管中,氮吹浓缩至1 mL,经0.22 μ m滤膜过滤,供UPLC-MS/MS测定。
本实验选用阳性鸡肉样品进行酶解条件试验,在未酶解条件下,分别采用pH 4.8 50 g/L 三氯乙酸、pH 5.2 20 mmol/L 乙酸铵、水、含1% (v/v)乙酸的水、含1%(v/v)乙酸的乙腈等溶液进行提取,测定结果见图1。为了测定鸡肉中残留的磷酸化利巴韦林代谢物,本实验选用酸性磷酸酶对样品进行酶解,分别考察了在以上5种溶液中的酶解效率,每个试验平行测定10次并计算其平均值(见图1),结果表明采用pH 4.8 50 g/L 三氯乙酸溶液时测定值为142.5 μ g/kg,但采用该溶液时的分析结果稳定性差,RSD为7.7% ;采用含1%(v/v)乙酸的水和含1%(v/v)乙酸的乙腈时测定值分别为139.5 μ g/kg和138.9 μ g/kg, RSD分别为4.8%和5.1% 。实验分别优化了酶解温度(25、37、45、55、65 ℃)和酶解时间(10、30、60、90、120、180、240 min)对于分析结果的影响,数据表明鸡肉样品中利巴韦林代谢物在37 ℃下酶解60～240 min测定值相当,为了缩短分析时间,本方法设定酶解条件为37 ℃酶解60 min。
利巴韦林分子结构中包含氨基、羟基等基团,其油水分配系数log P为-2.06,属强极性、水溶性化合物[ 10 ]。文献[ 9, 10, 14 ]报道生物样品中常用的提取溶剂主要有三氯乙酸溶液、乙酸铵溶液[ 8 ]、甲醇-二甲基亚砜溶液[ 11 ]、Tris缓冲液[ 4 ]、甲醇-Tris缓冲液[ 13 ]、乙腈[ 15 ]。本方法采用阳性鸡肉样品比较了50 g/L 三氯乙酸、20 mmol/L 乙酸铵、乙腈、含1%(v/v)乙酸的乙腈作为提取液的效果,结果表明采用以上4种溶液提取时测定值无显著差异,结果均在137.4～143.5 μ g/kg 之间,因此本方法选用含1%(v/v)乙酸的乙腈作为提取溶液。
生物组织及体液中利巴韦林的净化主要采用固相萃取法,分别为亲水亲脂平衡(HLB)、磺酸基强阳离子(MCX)、苯硼酸基弱阳离子(PBA)与氨基等固相萃取柱[ 2, 9, 12, 13 ]。本方法试验了以50 g/L 三氯乙酸、20 mmol/L 乙酸铵作为提取液进行固相萃取净化时的回收率,结果表明在HLB柱上的回收率为12.4% ～31.5% , MCX柱为7.2% ～21.6% 、PBA柱为24.6% ～43.7% 。鉴于此,为简化操作,本实验采用C18和PSA填料进行分散固相萃取；该方法中C18与样品中的脂溶性杂质结合,PSA可有效除去酸性干扰物质;实验结果表明采用该方法净化时利巴韦林的回收率≥92% 。
利巴韦林在C18色谱柱中保留性差,采用该色谱柱分析时,流动相中需含有90% ～100%(v/v)的水相[ 2, 8, 9, 11, 13, 14 ]。实验考察了Waters T3、Waters Atlantis C18、SHISEIDO MG2、SHISEIDO MG3等几种极性化合物分析柱,结果表明在流动相含95%水相的条件下利巴韦林在以上4种色谱柱的保留性均差。同时含高比例水相的流动相不利于电喷雾质谱的电离与挥发,利巴韦林在该条件下的检测灵敏度低。Shou等[ 15 ]采用硅胶柱在乙腈-三氟乙酸离子对体系中分离利巴韦林,该方法分析生物体液样品时基质效应超过50% 。本方法分别考察了利巴韦林标准溶液在纯硅胶色谱柱与硅胶基质的酰胺亲水色谱柱上的色谱行为,结果表明利巴韦林在纯硅胶柱中聚焦性差,呈双峰;在酰胺亲水柱中色谱保留性强,主要基于离子交换和极性互溶的混合作用力。在该酰胺亲水色谱体系中,水为强洗脱液,乙腈为弱洗溶剂,减少乙腈比例利巴韦林的保留时间缩短，增加乙腈比例则保留时间延长,同时挥发性溶剂乙腈也可提高质谱的检测灵敏度,因此本方法选用1.3节的色谱条件分离利巴韦林。
由于利巴韦林分子结构中存在易电离的氨基,采用1.0 mg/L 的质谱调谐溶液在正离子模式下进行母离子全扫描,结果显示化合物获得信号强度较高的[M+H]+峰m/z 245。以[M+H]+为母离子进行子离子全扫描,获得m/z 113、m/z 96和m/z 133主要子离子碎片;利巴韦林的m/z 113和m/z 133碎片主要是由呋喃核糖与三唑氮环断裂形成,m/z 96是由三氮唑羟乙胺中性丢失NH3获得(见图2)。根据2002/657/EEC关于确证法4个确证点的要求,选取丰度较强、干扰较小的两对子离子m/z 245/113和m/z 245/96为定性离子对,同时选取信号响应稳定的m/z 245/113为定量离子对,并优化DP、CE、EP、CXP、电喷雾电压、离子源温度、雾化气和气帘气等参数,获得1.3节所述的质谱参数。
分别在空白鸡肉、煎炸熟鸡肉制品中添加标准工作溶液,使其含量分别为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、200.0 μ g/kg,按1.4节方法处理后测定,分别以定量离子对的峰面积(Y)对含量(X, μ g/kg)进行线性回归计算,结果表明在1.0～200.0 μ g/kg 内线性关系良好,线性方程分别为Y=1.75×103X+1.42×104(相关系数(r)=0.9997)(鸡肉)和Y=1.46×103X+1.56×104(r=0.9991)(煎炸熟鸡肉)。以信噪比(S/N)≥3确定方法的检出限(LOD),以S/N≥10确定方法的定量限(LOQ),得到利巴韦林的LOD为1.0 μ g/kg, LOQ为5.0 μ g/kg。
利巴韦林标准溶液、空白生鸡肉及加标生鸡肉样品的色谱图见图3。
取空白生鸡肉、煎炸熟鸡肉样品添加3个水平的标准工作溶液(1×LOQ、2×LOQ、4×LOQ)进行回收率试验。每个添加水平平行测定10次,方法的回收率范围及相对标准偏差(RSD)见表1。
采用本方法对28个送检鸡肉样品进行分析,共检出阳性结果19个,其结果见表2。
建立了一种同时定性与定量测定鸡肉及其制品 中利巴韦林及其代谢物总残留量的分析方法,方法 的各项参数经验证后均符合相关法规要求。由实际样品测定结果可以看出目前我国养殖业确实存在滥用利巴韦林抗病毒药物的现象,兽药监管部门需制定相应措施,以确保人们的食品安全。
2013, Vol. 31 Issue (10): 934-938
PDF (814KB)
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