Thermo UltiMate 3000高效液相色谱仪, 带有双三元梯度泵(DGP-3600A), 配置六通道在线脱气机(SRD-3600)、自动进样器(WPS-3000TSL, 带大体积进样组件)、柱温箱(TCC-3200RS, 带2位十通切换阀)、二极管阵列检测器(DAD-3400RS); 变色龙色谱管理软件(Chromeleon^ 6.8 SR9), 美国赛默飞世尔公司。

乙腈(色谱纯), 去离子水(18.2 M Ω \5cm), 碳酸氢铵、甲酸、溴化钾均为分析纯。

含高浓度磷酸缓冲盐的寡核苷酸样品由江苏某生化制品公司提供; 经过纯化和除盐的牛血清蛋白(BSA)标准品由上海阿敏生物技术有限公司提供。

以对含有4 g/L KBr的BSA标准品溶液进行除盐为例, 描述本研究中在线串联固相萃取除盐单萃取柱模式的流程(见图1)。十通阀1-10位通时, 上样泵以0.1%(如无特殊说明均为体积分数)HCOOH溶液为流动相, 1.5 mL/min 流速进样。样品溶液中的BSA被保留在SPE柱(Acclaim PA II Guard, 10 mm×4.3 mm, 5 μ m)上, 而KBr不保留, 被淋洗出SPE柱。在SPE柱上完成除盐后, 通过阀切换使1-2位通, 分析泵以0.1% HCOOH溶液-乙腈(6 ∶ 4, v/v)为流动相, 1 mL/min 流速淋洗SPE柱, 将富集的BSA洗脱。通过流路①与MS直接连接进行分析(on-line SPE-MS), 或与紫外(UV)检测器连接直接进行在线固相萃取-流动注射(on-line SPE-flow injection)分析; 或通过流路②经过色谱柱(Acclaim PAⅡ, 33 mm×3.0 mm, 3 μ m)分离后进入MS进行分析(on-line SPE-LC-MS), 或使用紫外检测器进行分析(on-line SPE-HPLC)。

图1

Fig. 1

图1 在线固相萃取除盐单萃取柱模式的流程图 Fig.1 Schematic diagram of the on-line SPE desalting system of single SPE column mode

同样, 以对含有4 g/L KBr的BSA标准品溶液进行除盐为例, 描述本研究中的在线固相萃取除盐双萃取柱模式的流程(见图2)。上样泵和分析泵所用的流动相、色谱柱以及萃取和淋洗条件均与单柱模式相同。十通阀1-2位通时, 在SPE柱1上进样和除盐(周期1)。上样泵进样后, 样品溶液中的BSA被保留在SPE柱1上, 而KBr不保留, 被淋洗出SPE柱。当周期1完成, 将十通阀切换至1-10位通, 周期2(在SPE柱2上进样和除盐)开始, 其使用的SPE柱和条件均与周期1相同。与此同时, 分析泵将富集的BSA洗脱, 通过流路①与MS或与紫外检测器直接连接进行分析; 或通过流路②经过色谱柱(Acclaim 300 C18, 50 mm×4.6 mm, 3 μ m)分离后进入MS或紫外检测器进行分析。当周期2完成, 将十通阀切换回至1-2位通, 周期1又开始运转; 同时, 富集在SPE柱2上的BSA则被洗脱、检测或经过分离后检测。这样, SPE柱1和2轮流工作, 高效率地完成样品的在线除盐及检测。

图2

Fig. 2

图2 在线固相萃取除盐双萃取柱模式的流程图 Fig.2 Schematic diagram of the on-line SPE desalting system of dual SPE column mode

提高在线固相萃取除盐效果的方法一般有两种, 一是延长除盐时间, 也就是延长切阀时间; 二是增大除盐的流速。由于生化样品制备时通常所使用的缓冲盐溶液如磷酸盐溶液没有紫外吸收, 在方法开发时可以通过向样品溶液中加入有紫外吸收的盐如KBr来判断除盐效果。

图3

Fig. 3

图3 在线固相萃取除盐单萃取柱模式下不同质量浓度KBr溶液的流动注射分析色谱图 Fig.3 Chromatograms of on-line SPE-flow injection analysis of KBr solutions with different mass concentrations using the on-line SPE desalting single SPE column mode SPE column, Acclaim PA II Guard (10 mm×4.3 mm, 5 μ m); mobile phase, 5 mmol/L NH4HCO3; temperature, 30 ℃; flow rate, 1.0 mL/min for desalting; injection volume, 5 μ L; detection, UV at 215 nm.

图4

Fig. 4

图4 在线固相萃取除盐单萃取柱模式下的含有2.0 g/L KBr的寡核苷酸样品在除盐流速为(a)1.0 mL/min和(b)2.0 mL/min 时的高效液相色谱图 Fig.4 Chromatograms of on-line SPE-HPLC analysis of an oligonucleotide sample spiked with 2.0 g/L KBr and desalted at the flow rates of (a) 1.0 mL/min and (b) 2.0 mL/min using the on-line SPE desalting single SPE column mode Conditions for separation: analytical column, Acclaim PA II (33 mm×3.0 mm, 3 μ m); mobile phase, 5 mmol/L NH4HCO3-CH3CN (8 ∶ 2, v/v); flow rate, 1.5 mL/min; detection, UV at 254 nm; temperature, 30 ℃. Valve switching time, 1.0 min. Conditions for desalting were the same as in Fig. 3.

图3是单萃取柱模式下, 不同质量浓度KBr溶液进行在线固相萃取-流动注射分析的色谱图。可以观察到, 0.5 min时2.0和4.0 g/L 的KBr溶液尚有残余, 但1.5 min时4.0 g/L 的KBr溶液也已经完全除去, 表明延长固相萃取除盐时间, 在线固相萃取除盐效果得到提高。

图4是单萃取柱模式下不同除盐流速时, 含有2.0 g/L KBr的寡核苷酸样品的在线固相萃取-高效液相色谱图。如图4a所示, 除盐流速为1.0 mL/min 时寡核苷酸色谱峰后有一个小色谱峰。经过紫外吸收光谱比对可确认该峰是残留的KBr, 说明样品中的盐没有完全去除。而如图4b所示, 当除盐流速增大至2.0 mL/min 时该色谱峰消失, 表明样品中的盐已经去除。因此, 通过增大固相萃取除盐的流速, 可以提高在线固相萃取除盐效果。

通过计算双萃取柱模式下连续进样10次含有4.0 g/L KBr的BSA溶液(每个萃取柱上各5次), 所得到的BSA色谱峰(见图5)的保留时间和峰面积的RSD来评估在线固相萃取除盐方法的重现性。BSA保留时间的RSD为0.1% , 峰面积的RSD为1.0% , 说明该方法的重现性良好。

图5

Fig. 5

图5 在线固相萃取除盐双萃取柱模式下连续进样10次含有4.0 g/L KBr的BSA溶液(每个萃取柱上各5次)的高效液相色谱图 Fig.5 Chromatograms of 10 consecutive injections (5 injections for each SPE column) on on-line SPE-HPLC of BSA spiked with 4.0 g/L KBr using the on-line SPE desalting dual SPE column mode Conditions for desalting: SPE columns, two Acclaim PA II Guard(10 mm×4.3 mm, 5 μ m); mobile phase, 0.1% HCOOH; flow rate, 1.5 mL/min; injection volume, 5 μ L; temperature, 30 ℃. Conditions for separation: analytical column, Acclaim 300 C18(50 mm×4.6 mm, 3 μ m); mobile phase, 0.1% HCOOH-CH3CN (6 ∶ 4, v/v); flow rate, 1.0 mL/min; detection, UV at 280 nm; temperature, 30 ℃. Valve switching time, 1.0 min.

图6

Fig. 6

图6 在线固相萃取除盐双萃取柱模式下连续进样8次寡核苷酸样品(每个萃取柱上各4次)的高效液相色谱图 Fig.6 Chromatograms of 8 consecutive injections (4 in- jections for each SPE column) on on-line SPE-HPLC of the oligonucleotide sample using the on-line SPE desalting dual SPE column mode Conditions for desalting: SPE columns, two Acclaim PA II Guard (10 mm×4.3 mm, 5 μ m); mobile phase, 5 mmol/L NH4HCO3; flow rate, 1.5 mL/min; injection volume, 2 μ L; temperature, 30 ℃. Conditions for separation: analytical column, Acclaim PA II (33 mm×3.0 mm, 3 μ m); mobile phase, 5 mmol/L NH4HCO3-CH3CN (8 ∶ 2, v/v); flow rate, 0.8 mL/min; detection, UV at 254 nm; temperature, 30 ℃. Valve switching time, 0.4 min.

当样品溶液中的盐浓度不高时, 采取双萃取柱模式, 通过适当缩短阀切换时间可以大大提高在线固相萃取除盐的效率; 但频繁的阀切换可能会导致方法重现性的降低。因此, 机械性能良好的双梯度泵是实现这一目的的保证。图6是磷酸缓冲盐质量浓度低于1.0 g/L 的寡核苷酸样品在双萃取柱模式下的液相色谱图, 阀切换时间缩短至0.4 min, 连续进样8次(每个萃取柱上各4次)。除盐、淋洗和分离测定在1.1 min即可完成。寡核苷酸保留时间的RSD为0, 峰面积的RSD为1.5% 。