HPLC系统由P1201泵、UV1201多波长紫外分光检测器、Rheodyne-7725i进样阀及依利特色谱工作站EC2006组成(大连依利特公司); 超纯水由Arium 611超纯水仪(德国Sartorius公司)纯化。

氨基硅填料(10 μ m)购自大连依利特公司; 戊二醛购自上海凌峰试剂有限公司; 万古霉素购自上海阿拉丁公司; 甲醇、乙腈(色谱纯)购自山东禹王实业有限公司; NaBH₄、NaH₂PO₄、NaCl、对氨基苯甲酸、苯甲酸购自上海凌峰化学试剂有限公司; 扑尔敏、氨基比林、巴比妥、烯丙异丙基巴比妥、安定片、盐酸麻黄碱、氯氮平购自公安部物质鉴定中心; 三唑仑购自中国药品生物制品检定所; 甜菊糖粗品由江西北洋食品添加剂有限公司提供。

按照雷雯等^{[ 14 ]}的方法,利用氨基硅胶颗粒作为基质,合成出万古霉素键合固定相。

将制备好的色谱固定相装填入250 mm×4.6 mm的不锈钢色谱柱管中。装柱压力为70 MPa,匀浆液为丙酮,顶替液为乙醇。

在反相模式等度洗脱条件下,以20%(体积分数,下同)乙腈为流动相,以尿嘧啶、萘、芴为样品对万古霉素键合固定相进行评价。如表1所示,3种物质的出峰顺序为尿嘧啶、萘、芴,符合反相模式机理。尿嘧啶的柱效为1.35×10⁴ 塔板/m。分离柱效偏低的主要原因是本文采用粒径为10 μ m的硅胶颗粒合成万古霉素键合固定相,但较大粒径硅胶颗粒可用于填充制备色谱柱。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 万古霉素键合固定相在反相模式下分离尿嘧啶、萘、芴 Table 1 Separation results of uracil, naphthalene and fluorene in reversed-phase mode using vancomycin-bonded stationary phase Compound Retention time/min Retention factor Uracil 3.78* 0 Naphthalene 16.98 3.49 Fluorene 35.74 8.46 Mobile phase: acetonitrile-water (20 ∶ 80, v/v); flow rate: 1.0 mL/min; detection wavelength: 254 nm. * Dead time.

表1 万古霉素键合固定相在反相模式下分离尿嘧啶、萘、芴 Table 1 Separation results of uracil, naphthalene and fluorene in reversed-phase mode using vancomycin-bonded stationary phase

在反相模式下,将万古霉素固定相应用于5种药物的分离。以30%甲醇为流动相,扑尔敏、氨基比林、巴比妥、烯丙基异丙基巴比妥、安定等5种药物按照极性由强到弱的顺序依次流出色谱柱(见图2)。其中烯丙基异丙基巴比妥与巴比妥相比,结构上多了2个烷基,疏水性更强,保留时间更长。因此,实际药物分离结果符合反相模式的机理。

图2

Fig. 2

图2 反相模式下5种药物的分离谱图 Fig.2 Chromatogram of five drugs in reversed-phase mode Column: 250 mm×4.6 mm, vancomycin-bonded stationary phase; mobile phase: methanol-water (30 ∶ 70, v/v); flow rate: 1.0 mL/min; detection wavelength: 214 nm. Peaks: 1. chlor-trimeton; 2. aminopyrine; 3. barbital; 4. allyl isopropyl barbitone; 5. diazepam.

在高浓度有机溶剂(85%乙腈)洗脱条件下,以尿嘧啶和萘为样品评价万古霉素键合固定相。萘和尿嘧啶出峰顺序与低有机调节剂条件下相反,显示出与反相模式相反的分离特征。反相模式下,样品与固定相间疏水相互作用较强而可能存在的其他分离机制的分离能力相对较弱。当有机调节剂浓度增加时,固定相与流动相的极性差相对变小,使得疏水作用对总体分离结果的影响变弱,而其他相互作用的影响相对增强,宏观表现为分离模式的改变。因此强极性的尿嘧啶保留时间更长,符合亲水模式分离机理(见图3a)。亲水模式分离条件下,萘的柱效为1.27×10⁴ 塔板/m。

图3

Fig. 3

图3 亲水模式下的分离谱图 Fig.3 Chromatograms in HILIC mode Mobile phase: acetonitrile-water (85 ∶ 15, v/v); detection wavelength: (a) 254 nm； (b) 210 nm; for other conditions see Fig. 2. Peaks: (a) 1. naphthalene; 2. uracil. (b) 1. stevioside (STV); 2. rebaudioside C (RC); 3. rebaudioside A (RA).

在上述亲水模式条件下,对甜菊糖粗品进行分离。甜菊糖是从菊科草本植物甜叶菊中精提的新型天然甜味剂,主要包含甜菊甙(STV)、莱鲍迪甙A(RA)、莱鲍迪甙C(RC)等组分,RA和STV为主要成分。如图3b所示,STV具有疏水性,保留较弱,最先出峰,符合亲水模式的机理。

与固定相共价相连的荷电基团决定离子交换色谱柱的特性:阴离子交换固定相表面带正电荷,阳离子交换固定相表面带负电荷。以对氨基苯甲酸和苯甲酸为样品考察了万古霉素键合固定相的离子交换色谱分离特征,结果如图4所示。

图4

Fig. 4

图4 氨基苯甲酸和苯甲酸的分离色谱图 Fig.4 Chromatograms of the separation of para aminobenzoic acid and benzoic acid Mobile phases: A. 10 mmol/L NaH2PO4 (pH 4.5); B. 10 mmol/L NaH2PO4-0.5 mol/L NaCl; detection wavelength: 215 nm; for other conditions see Fig. 2. Peaks: 1. para aminobenzoic acid; 2. benzoic acid.

采用NaCl线性梯度洗脱确定对氨基苯甲酸和苯甲酸的相对保留值后,研究了该固定相在不同等度洗脱条件下的分离能力。当流动相中盐浓度为0.225 mol/L(45%B)时,对氨基苯甲酸和苯甲酸获得基线分离(见图4)。由于万古霉素的pI为7.20,在pH 4.5流动相条件下带正电荷; 对氨基苯甲酸和苯甲酸的pK_a分别为4.92和4.20,在此条件下分别带正电荷和负电荷。因此,苯甲酸保留更强,符合阴离子交换固定相分离机理。分别在NaCl浓度为0.1、0.5、1.0 mol/L条件下考察对氨基苯甲酸和苯甲酸的分离度。发现当盐浓度为0.5 mol/L 时,两种物质获得较好分离。原因可能是当盐浓度过高,溶剂中的负电荷与固定相作用结合位点作用增强,流动相洗脱能力过强; 而当盐浓度过低时,溶剂中的负电荷与固定相作用结合位点作用较弱,流动相洗脱能力减弱,保留较强的苯甲酸无法洗脱。同时考察流动相pH为3.8、4.5、5.7时对对氨基苯甲酸和苯甲酸的分离的影响,发现随着pH的增大保留时间增加。原因是样品在不同pH下所带电荷不同,与万古霉素之间作用存在差异。

扑尔敏、盐酸麻黄碱、三唑仑以及氯氮平4种药物极性较强,在反相模式下保留较弱,死时间即流出色谱柱。当对这4种极性药物进行离子交换模式分离时,其保留显著增强,符合阴离子交换机理(见图5)。在阴离子交换模式下,扑尔敏的柱效为1.34×10⁴ 塔板/m。

图5

Fig. 5

图5 阴离子交换模式下4种极性药物的分离色谱图 Fig.5 Chromatogram of four polar drugs in anion-exchange mode Mobile phase: A. 10 mmol/L NaH2PO4 (pH 3.8); B. 10 mmol/L NaH2PO4-0.5 mol/L NaCl. Gradient elution: 0-30 min, 10%B-90%B; detection wavelength: 215 nm; other conditions see Fig. 2. Peaks: 1. chlor-trimeton; 2. ephedrine hydrochloride; 3. triazolam; 4. clozapine.

为了考察制备方法的重复性,分别采用不同批次制备的万古霉素键合固定相填充了3根色谱柱,以30%甲醇为流动相,测定扑尔敏、氨基比林和巴比妥保留时间的相对标准偏差小于15% 。

采用戊二醛间隔臂法制备的万古霉素键合固定相稳定性较好,连续在不同分离模式下使用3个月,重复进样300余次,仍能保持良好的分离能力。