高糖DMEM培养液(Dulbecco’s modified eagle medium)为Hyclone公司产品,胎牛血清为Wisent公司标准级胎牛血清; 细胞培养瓶等耗材为Corning公司产品。与浓缩纯化分泌蛋白质相关的三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)和四氢呋喃(tetrahydrofuran, THF)为Sigma公司产品; 与蛋白质溶液酶解和LC-MS联用相关的乙腈(acetonitrile, ACN,高效液相色谱纯)和水(色谱纯)为Sigma公司产品; 甲酸(色谱纯)和碘乙酰胺(iodoacetic acid ammonium, IAA)为Fluka公司产品; 二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)为Amresco公司产品; 胰蛋白酶为Promega公司产品; Sep-Pak C18柱为Waters公司产品; 实验用水为Milli-Q去离子水；MHCC97L细胞系来自上海市复旦大学中山医院肝癌研究所; 与等电聚焦相关的试剂及IPG胶条均为Agilent公司产品。

等电聚焦仪OFFGEL(美国Agilent公司); 超速离心机(美国Beckman公司); Speed Vac真空干燥机(美国Thermo公司); Easy-Nano LC液相色谱仪和LTO-Orbitrap Velos质谱仪(美国Thermo公司); 反相色谱柱(10 cm×75 μ m,美国New Objective公司); Nanodrop定量仪(美国Thermo公司)。

人肝癌细胞系MHCC97L^{[ 9 ]}在含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中传代培养,至细胞密度为60% ～70%时弃去培养基,用杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s phosphate buffered saline, DPBS)轻轻洗涤3遍,再用条件培养基(无血清)轻轻洗涤2遍,加入条件培养基培养,24 h后收集培养基^{[ 5, 10 ]}。

收集培养基,于 1000 g下离心5 min,收集上清; 再于 100000 g下超速离心1 h,收集上清。采用在Chevallet等^{[ 11 ]}的沉淀法基础上优化后的方法,在纯化好的培养基上清中加TCA(终质量分数为12% )静置过夜; 于 25000 g下离心20 min后弃去上清; 加2 mL预冷的THF,振荡,使沉淀完全溶解; 于 10000 g下离心10 min后弃去上清; 重复加入THF离心1次; 最后用裂解液(8 mol/L 尿素)溶解蛋白质,也可超声1 min助溶(超声1 s,间隔1 s); 以上步骤均在4 ℃下完成。

采用Nanodrop仪对蛋白质溶液进行定量,之后加入终浓度为10 mmol/L 的DTT, 于37 ℃下反应4 h; 再加入终浓度为50 mmol/L 的IAA,室温、黑暗条件下反应1 h; 然后用50 mmol/L 的NH₄HCO₃稀释,至溶解蛋白质的尿素浓度为1 mol/L,按50 ∶ 1(w/w)加入胰蛋白酶,于37 ℃下水浴中酶切过夜; 次日加入终体积分数为0.1%的甲酸(FA)终止酶切^{[ 5 ]}; 用Sep-Pak C18柱脱盐(具体方法见其说明书),然后冻干。

用OFFGEL水化液溶解冻干的肽段,Nanodrop仪定量,用pH 3～10的IPG胶条(Agilent公司)分12组上样,具体操作按其说明书^{[ 6, 7 ]}。聚焦结束后,分别移出1～12馏分里的样品,加入终体积分数0.1%的FA。然后进行Stage-tip脱盐,按顺序加入50%ACN、0.1%FA、样品、0.1%FA、50%ACN试剂各两次(每次100 μ L); 冷冻干燥肽段样品。

将冻干的肽段重溶于流动相A液(0.1%FA-H₂O)中,进行在线液相色谱-质谱联用(Easy Nano LC, Proxen, LTQ-Orbitrap Velos, Thermo)分析。反相色谱柱采用Magic^TM C18柱(10 cm×75 μ m, 3 μ m)。流动相B液为0.1%FA-ACN,流速为350 μ L/min。

质谱条件:纳升级电喷雾电离方式(Nano-ESI),正离子模式扫描,电离电压 1800 V,离子入口毛细管温度250 ℃,扫描范围m/z 350～1200,动态排除时间75 s,质量数据由XCalibur采集处理。

采集的质谱数据用Proteome Discoverer 1.2软件根据Mascot算法搜索数据库Refseqhuman.20120320(蛋白质数目为 33778)。数据库搜索参数为:肽段质量误差(peptide tolerance)为10×10^-6,肽段碎片离子质量误差(fragment ion tolerance)为0.5 Da; 酶(enzyme)为胰蛋白酶(trypsin),漏切位点(missed cleavage sites)为1; 单同位素分析; 固定修饰(fixed modification)为carboxyamidomethylation (C); 可变修饰(variable modification): oxidation(M); 按肽段匹配假阳性率(false discovery rate, FDR)为1%输出搜库结果。

用北京蛋白质组中心开发的软件Proteomics_tools分析肽段理论等电点(isoelectric point, pI); 采用在线免费软件SecretomeP和SignalP分析分泌蛋白质的分泌途径^{[ 12 ]}; 对具有信号肽的蛋白质,用TMHMM分析其跨膜区(transmembrane domains, TMDs)及跨膜螺旋区域(transmembrane helices, TMHs)^{[ 13 ]}。

等电聚焦分级系统依据等电点对多肽进行分离。其原理为:氨基酸在电场作用下电离,碱性肽段带负电荷向阳极移动,酸性肽段带正电荷向阴极移动,当胶条及环境溶液的pH恰好等于聚焦肽段分子的pI时,肽段失去电荷而停止移动,从而达到聚焦目的而分布于不同的馏分中。采用蛋白质组学中的鸟枪法(shotgun)策略,首先把蛋白质样本酶切成肽段混合物,然后利用肽段等电点的不同实现分离。所得的肽段等电点经过Proteomics_tools分析,结果见图2。

图2

Fig. 2

图2 鉴定肽段的实际等电点分布 Fig.2 pI Distribution of the identified peptides

如图2所示,每个双箭头线段代表鉴定到肽段理论计算的pI范围。第9组馏分实际等电点的范围是6.7～7.1, pI范围差为0.4,为所有馏分中最小; 第10组馏分的实际等电点范围是8.2～9.7, pI范围差达1.5,为最大。pI在碱性段的3组馏分的实际等电点范围分别为8.2～9.7、8.2～9.7、8.5～9.8,分布相差无几,且各组馏分内部pI范围差均＞1.3,远大于之前9组馏分内部pI范围差。所以,酸性条件(pH 3～6)下鉴定到肽段的等电点在馏分间区分明显; 中性条件(pH 6～8)下,馏分间等电点分布依旧区分明显,并呈依次递增态势,且上述两部分的每组馏分等电点动态偏差较小; 而在碱性端(pH 8～10),馏分之间肽段的等电点区分不很明显,分布在周围的几组馏分里,说明OFFGEL对低等电点肽段的聚焦效果好于对高等电点的肽段。

由于pH 3～10的IPG胶条为线性胶条,每个馏分等电点分布理论上是呈线性,即按pH间隔约0.6分布(pH 3.0、3.6、4.2、4.8、5.4、6.0、6.6、7.2、7.8、8.4、9.0、9.6、10.2),且实际值同样呈线性增长。图3中所示的理论值代表了IPG胶条按pH 3～10线性分布的理论值,实际值是指每个馏分中质谱鉴定到的肽段等电点的均值。可以看出各馏分肽段的等电点分布与理论线性接近,同样呈递增趋势,酸性和中性范围(pH 3～7)内实际值接近理论值,中性偏碱性和碱性范围(pH 8～10)内实际值稍微偏离理论值,但最大偏差仅为1.5。除了馏分9的肽段pI分布偏差达1.5外,其余馏分与理论值的平均偏差＜0.4,符合精确分级分离等电聚焦仪的分离要求^{[ 6 ]}。

图3

Fig. 3

图3 肽段等电点的理论值和实测值的整体趋势分布 Fig.3 Distribution of the theoretical and practical pI values of the identified peptides

图4显示的是MHCC97L分泌蛋白质样本经过OFFGEL等电聚焦预分离后各个馏分鉴定的肽段及其蛋白质数的分布。从图4可知,肽段分布集中在3段:馏分1、2(pH 3～5)肽段最多,馏分4～8(pH 5～8)和馏分11、12(pH 9～10)次之。馏分3、9、10由于鉴定肽段较少使得整个分布趋势呈不均匀态。为了探究这一分布的原因,考察了7种带电氨基酸:天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)、酪氨酸(Y)以及蛋白质C端肽的分布(见图5)。

图4

Fig. 4

图4 OFFGEL馏分中鉴定到的肽段和蛋白质数量的分布 Fig.4 Number distribution of the identified peptides and unique proteins in OFFGEL fraction wells

图5

Fig. 5

图5 (a)D、E、K、R和(b)C、H、Y等7种带电氨基酸在肽段上的平均分布及(c)C末端信号肽序列在等电聚焦中的分布 Fig.5 Average distributions of the charged amino acids of (a) D, E, K, R, (b) C, H, Y per peptide and (c) C-terminal signal peptides related in each OFFGEL fraction

计算鉴定肽段中每种氨基酸含量的平均值。图5a中酸性氨基酸D和E的整体分布呈递减的趋势,符合理论预期,前3个馏分平均每个肽段含有接近2个E和至少1个D,文献^{[ 14 ]}中报道理论上每个基本的肽段平均仅含有0.2个此类氨基酸。而由于R和K是胰蛋白酶的酶切位点,两者分布很接近; 如果没有漏切的话,K和R的含量均值之和应为1。从图5a看出,K的分布基本符合预期,而R仅仅在倒数第2个馏分中大于1。这意味着仅有约20%的肽段包含1个精氨酸残基,而80%的肽段至少含有1个赖氨酸残基,与文献^{[ 14, 15 ]}报道一致。图5b中C残基并不影响肽段在各个馏分中的分布,可以推断该样本中此种氨基酸含量较少。而Y在馏分1～6中分布接近,而在碱性端分布平均值高达1,表明该氨基酸的碱性侧链导致其在馏分10～11中丰度很高。H在馏分7～8(pH 7～8)中最多,其等电点为7.59,其分布符合理论预期。蛋白质C端没有胰蛋白酶的酶切位点,与其他肽段相比末端可能少一个碱性基团(K或R),因此应分布于低pH值端。从图5c中可以看出在馏分1和2中C端肽分布最多,馏分1～7中分布较多,而馏分9～12中数量骤减。因此,OFFGEL等点聚焦有可能作为一种C末端肽的富集技术来使用。

综上所述,该等电聚焦系统分离肽段pI的实际值与理论值接近,精确分级性能与预期相符合,能满足复杂样品的预分离要求。

等电聚焦分级成12个馏分后,每个馏分里肽段等电点的分布为一个范围。鉴于IPG胶条呈线性,少量肽段出现在相邻的馏分里也不足为奇。当然对于精确聚焦的分级分离系统,这种现象越少越好。如图6所示,有接近80%的肽段是专属于1个馏分的,有17%的肽段分布在2个馏分里,仅有4%的肽段分布在3个馏分里。而文献^{[ 16 ]}报道,溶液状态下对带电性质不同的肽段进行的离子交换色谱预分离,获得35个组分,几乎每个组分间pI非常接近(pI范围＜3)且等电点重叠度极高,肽段在pI水平的预分离程度远不及OFFGEL区分明显(OFFGEL等电聚焦预分离的pI范围为3～10,重叠度较小)。因此运用OFFGEL可以获得更好的肽段聚焦效果。

此外,从鉴定到的蛋白质数分布中发现,馏分1～3中鉴定到的单个蛋白质(unique proteins)占到蛋白质鉴定总数的40% ; 肽段总数在馏分1～12中的分布不均匀,前两个馏分中肽段最多,有类似递减的趋势(见图6)。蛋白质经过理论酶切后预测所产生的肽段等电点分布范围呈现同样的分布,说明OFFGEL等电聚焦分离方法对不同肽段没有歧视效果,这一点与文献^{[ 17, 18 ]}报道一致。运用OFFGEL等电聚焦分离肽段,pI 4.0～5.5部分会集中较多数量的肽段,也就是OFFGEL中的1～3馏分,最多可达到60%左右。当然这也和肽段本身的属性有关。

图6

Fig. 6

图6 OFFGEL组分馏分中鉴定到的肽段数量 Fig.6 Number of the distinct peptides identified from OFFGEL fractions

从分泌样本的鉴定结果来看,MHCC97L样本经过OFFGEL等电聚焦预分离后共鉴定到 2995 个蛋白质(见图4和图6),远远超出文献^{[ 5, 6 ]}报道的分泌蛋白质组平均单个样本的鉴定数量(800～1300),显示了OFFGEL等电聚焦技术的高分辨分离能力。其与新型质谱联用可以达到分泌蛋白质组的深度覆盖。

对鉴定到的肝癌细胞分泌组注释结果如图7所示,其中913个蛋白质没有信号肽,预测为非经典的分泌蛋白质; 400个蛋白质有信号肽,没有跨膜区,预测为经典分泌蛋白质^{[ 15, 19 ]}。另外247个蛋白质被TMHMM软件预测为具有一个或多个跨膜区的膜蛋白质。因此,鉴定到的分泌蛋白质组成分占到总鉴定蛋白质的52% ,该结果与报道的数据相吻合,但数量远远超出已报道的分泌蛋白质组鉴定结果^{[ 5 ]}。值得一提的是,膜蛋白质往往容易脱离质膜释放到胞外空间,也就是细胞外基质中。因此膜蛋白质也被计算到分泌蛋白质组的总数中。

图7

Fig. 7

图7 鉴定到的蛋白质的细胞定位 Fig.7 Cellular location of the identified proteins