目前用于喹诺酮类药物残留的检测方法有微生物法[ 4, 5, 6 ]、高效液相色谱法[ 7, 8, 9 ]、高效液相色谱-质谱联用法[ 10, 11, 12, 13, 14, 15 ]、酶联免疫分析法[ 16, 17, 18 ]、毛细管区带电泳法[ 19 ]等, 基质主要是畜禽、水产品的肌肉、内脏等组织及副产品[ 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 19 ], 对火锅食材、火锅底料等成分复杂、油性大的基质检测还没有相关报道。
QuEChERS法是由Anastassiades等[ 20 ]开发的一种快速(quick)、简单(easy)、廉价(cheap)、高效(effective)、耐用(rugged)、安全(safe)的分散固相萃取方法, 由于该方法有简单易行、稳定可靠的优点, 现已被用于农药残留[ 21, 22 ]和兽药残留[ 23, 24, 25, 26 ]的检测。现在常用的普通液液萃取和固相萃取柱的方法存在提取不完全、基质干扰大等问题, 不适用于各种火锅食材样品中喹诺酮类药物的检测。针对上述问题, 本文将QuEChERS法和超高效液相色谱-串联质谱有机结合起来, 对提取净化方法、色谱-质谱条件进行了改进和优化, 建立了一种分散固相萃取净化结合超高效液相色谱-串联质谱同时检测火锅食材中11种喹诺酮类药物的方法。
Agilent 1290UPLC-6490A超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(美国Agilent公司); 漩涡混合器VOATEX-2(Scientific Industries); SB5200型超声波清洗机(美国Branson公司); CF16RXⅡ型高速冷冻离心机(日本Hitachi公司); Milli-Q超纯水(美国Millipore公司); 氮吹浓缩仪(美国Organomation Associates公司)。
恩诺沙星(enrofloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、达氟沙星(danofloxacin)、沙拉沙星(sarafloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、培氟沙星(pefloxacin)、二氟沙星(difloxacin)、奥比沙星(orbifloxacin)、马波沙星(marbofloxacin)均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司(纯度＞99.0% )。乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯, 氯化钠、醋酸钠、乙酸铵、硫酸镁均为分析纯; N-丙基乙二胺吸附剂(PSA, Agilent公司), 十八烷基键合硅胶吸附剂(C18, Agilent公司), 石墨化炭黑(GCB, Agela公司); 微孔滤膜(0.22 μ m)。
分别精密称取11种喹诺酮类药物标准品, 折合成目标化合物20 mg(精确至0.1 mg)置于100 mL棕色容量瓶中, 用乙腈溶解并定容至刻度, 混匀配制成200 mg/L 的单标储备液; 分别准确移取1 mL各单标储备液置于100 mL棕色容量瓶中, 用乙腈定容至刻度, 配成2 mg/L 的混合标准中间液; 根据需要移取适量混合标准中间液, 用乙腈-水(含0.1%甲酸)(1 ∶ 1, v/v)稀释成适用浓度的标准工作溶液。各种标准溶液密封保存于4 ℃冰箱中。
将样品用食品加工机充分搅拌、均质, 分出0.5 kg作为试样, 置于清洁的样品容器中, 密封, 并做好标记。将制备好的试样于0～4 ℃下冷藏保存。
菜类:称取15.0 g样品至50 mL离心管中, 加15 mL含5%甲酸的正己烷饱和的乙腈、3.0 g醋酸钠和3.0 g氯化钠, 剧烈振荡, 超声提取15 min, 于 6000 r/min 下离心5 min, 吸取上清液10 mL于10 mL离心管中, 提取液待净化。
调味料、肉制品、脱水制品等:称取5.0 g样品至50 mL离心管中, 加入10 mL水剧烈振荡摇匀, 浸泡15 min, 然后加入15 mL含5%甲酸的正己烷饱和的乙腈、3.0 g醋酸钠和3.0 g氯化钠, 剧烈振荡, 超声提取15 min, 于 6000 r/min 下离心5 min, 吸取上清液10 mL于50 mL离心管中, 提取液待净化。
提取液中依次加入500 mg C18、200 mg PSA、1.0 g无水硫酸镁, 轻微振荡1 min, 于 5000 r/min 下离心5 min, 分取上层净化液2.0 mL, 氮气吹干, 加入2.0 mL乙腈-水(含0.1%甲酸)(1 ∶ 1, v/v)溶解并定容(若有油脂可再加入0.8 mL乙腈饱和的正己烷去除), 过0.22 μ m微孔滤膜, 滤液供液相色谱-质谱测定。
色谱柱:Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×3.0 mm, 2.7 μ m); 柱温:35 ℃; 进样量:5 μ L; 流速:0.25 mL/min。流动相:A为5 mmol乙酸铵-0.1%甲酸水, B为甲醇。梯度洗脱程序:0～2.0 min, 90%A; 2.0～6.0 min, 90%A～10%A; 6.0～7.0 min, 10%A～90%A; 7.0～8.0 min, 90%A。
离子源:电喷雾电离, 正离子模式(ESI+); 毛细管电压:3.0 kV; 离子源温度:120 ℃; 脱溶剂气:N2; 脱溶剂气温度:350 ℃; 脱溶剂气流速:750 L/h; 碰撞气:高纯Ar; 扫描方式:多反应监测(MRM)。11种喹诺酮类药物的质谱分析参数见表1。
喹诺酮类化合物的分子结构中含有羧基和叔胺基, 具有酸碱两性性质, 易溶于酸性或碱性溶液。文献报道的提取方法大多用纯有机溶剂(乙腈、甲醇、二氯甲烷等), 而在有机溶剂中添加一定比例的酸或碱等提取可显著提高回收率[ 24, 25 ]。本文首先考察了QuEChERS法常用提取溶剂(乙腈、乙酸乙酯)的提取效果。试验发现, 乙腈与乙酸乙酯的提取回收率相当; 但用乙酸乙酯提取的溶剂颜色较深, 表明其带出了弱极性基质成分, 这将增加后续净化的难度; 乙腈在有效提取目标物的同时具有沉淀蛋白质的作用, 且其带出的弱极性成分少, 反映在质谱上响应高、基质影响小, 因而选用乙腈作提取溶剂。
本文在已有研究[ 23, 24, 25, 26 ]的基础上, 进一步采用含5%甲酸的正己烷饱和的乙腈溶液作为提取溶剂进行提取试验。正己烷饱和的乙腈在提取过程中能更好地起到浸润的作用, 降低了提取溶液及含水基质提取液中的水分, 从而减轻了后续的除水压力。结果表明, 该提取试剂不仅去除脂肪和蛋白质的效果好, 而且容易浓缩, 提取回收率也可满足要求。
另外, 在提取时, 比较了直接乙腈提取与先加水分散再用乙腈提取的处理方法, 结果(见图1)表明, 先加水将样品充分分散后再用乙腈提取可获得更高的回收率, 这可能与乙腈具有的蛋白质凝结作用有关, 凝结的蛋白质阻碍了其进入内部发生作用, 所以选择先加水分散再用乙腈提取的处理方法。
分散固相萃取是QuEChERS方法的净化手段, PSA、C18、GCB是常用的吸附剂。采用PSA分散性固相萃取净化, 可有效去除乙腈提取液中脂肪酸、糖类、酚类以及极性色素等成分; C18具有良好的除脂能力; GCB可去除提取液中的色素成分, 但对含苯环官能团的化合物有较强的吸附作用。禽肉中含有丰富的蛋白质(用乙腈提取时已被沉淀)及脂肪类物质, 而目标物几乎都含有苯环, 故本研究只选取PSA、C18作为净化吸附剂进行优化。
为考察这2种吸附剂对11种目标物的吸附情况, 在同一浓度水平的混合标准溶液中分别加入100 mg的2种吸附剂充分混匀1 min, 过0.22 μ m滤膜后测定, 发现PSA对待测物的吸附稍强, 11种目标物均有一定损失, 吸附率在20% ～50%之间; 而C18对大多数目标物吸附较少, 吸附率在10%左右, 可作为净化剂进一步优化。根据提取液中残留脂肪和水分的含量特点, 考察了100～300 mg PSA及200～500 mg C18按不同比例组合的净化效果(见图2)。结果表明, 采用200 mg PSA、1000 mg无水硫酸镁及500 mg C18为净化剂组合进行分散固相萃取时, 样品溶液澄清, 基质干扰较小, 回收率最佳。
将最终净化液在氮气下缓缓吹干, 某些复杂基质会有少许黄色液滴, 可在定容后加入0.8 mL乙腈饱和的正己烷, 振荡离心后去除, 过微孔滤膜后溶液即澄清。
为维持流动相的低pH值以抑制硅醇基的解离和保证喹诺酮类化合物在流动相中的稳定溶解状态。本文采用0.1%甲酸或乙酸来控制流动相的pH值, 试验发现二者均可得到对称、尖锐的峰形, 但甲酸更利于喹诺酮类化合物的离子化, 可得到较高的检测灵敏度, 故本实验中选择用0.1%甲酸控制流动相的pH值, 可以提高灵敏度, 并且加入微量的NH+4可使峰形更尖锐、响应更稳定。最终本实验选择5 mmol乙酸铵-0.1%甲酸水作为流动相A。
实验还对定容溶液进行了选择, 发现采用不同的溶剂作为标准稀释液或样品处理后的复溶溶液会对质谱响应及色谱峰形产生显著影响。比例过高的有机溶剂能明显增强质谱响应, 但同时也会造成部分化合物的色谱峰形坍塌, 比例过低的有机溶剂不能完全溶解目标物。经多次试验, 确定以乙腈-水(含0.1%甲酸)(1 ∶ 1, v/v)溶液作为定容溶液, 可获得对称、尖锐的峰形和良好的质谱响应。
喹诺酮类化合物因含有羰基等多电子基团而适合在ESI源的正离子模式下形成[M+H]+准分子离子，以此作为母离子。在ESI模式下分别对1.0 mg/L 的11种QNs的单标准溶液进行全扫描得到准分子离子峰, 再通过优化碰撞能量等参数得到11种药物的子离子。11种药物的定量和定性子离子及相应的质谱参数见表1。
尽管样品经乙腈沉淀蛋白质、分散固相萃取后得到了良好的净化, 但仍无法完全消除基质效应。本文在建立方法过程中, 发现大部分QNs均存在不同程度的基质效应, 且均为抑制效应。综合考虑, 本方法采用蔬菜类、肉类及火锅底料类3种空白样品配制基质匹配标准溶液, 很好地消除了基质影响(见表2), 完全能满足喹诺酮类药物残留检测的要求。
采用基质加标工作曲线进行外标法定量。根据基质的不同, 按上述方法进行提取、净化和浓缩, 采用不同浓度的标准溶液进行定容、检测, 得到基质加标工作曲线。实验表明, 在1.0～100.0 μ g/L 范围内, 11种喹诺酮类药物的线性方程相关系数均大于0.998。分别根据3倍和10倍信噪比确定化合物的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。11种喹诺酮类药物的线性方程、相关系数、LOD和LOQ见表3。
在不同的火锅食材样品中添加喹诺酮类标准溶液, 分别添加3个不同浓度水平的混合标准溶液, 每个水平重复测定6次, 采用外标法进行定量, 计算回收率和精密度(以相对标准偏差表示)。图3为火锅底料中11种QNs类药物的MRM谱图。结果表明, 本方法11种药物的回收率范围为70.1% ～100.3% , RSD都小于11%(见表4), 表明本方法有良好的准确度和精密度, 满足喹诺酮类药物痕量分析的要求。
为验证该方法的可靠性, 从超市购买了18种火锅底料、蔬菜、豆腐、蘑菇、禽肉制品进行测定, 同时作质控样品。样品均未检出QNs药物残留, 质控样品的回收率等指标均达到分析要求, 表明结果准确、可靠。下一步准备扩大取样, 准备从火锅店抽取样品进行检测。
本文建立了同时检测火锅食材中11种喹诺酮类药物残留的分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法。采用酸化乙腈溶液提取后进行分散固相萃取净化, 有效提高了提取率, 减少了杂质的干扰, 快速、简洁。在优化了提取和净化方法的同时, 采用基质匹配标准溶液的方法很好地消除了基质影响, 提高了检测灵敏度。该方法作为火锅食材中11种喹诺酮类药物残留的确证方法, 具有简便、灵敏、准确的优点, 可以更有效地监控市场违法添加喹诺酮类药物的行为, 保证人民食品安全。
目前用于喹诺酮类药物残留的检测方法有微生物法[ 4, 5, 6 ]、高效液相色谱法[ 7 ...
QuEChERS法是由Anastassiades等[ 20 ]开发的一种快速(quick)、简单(easy)、廉价(cheap)、高效(effective)、耐用(rugged)、安全(safe)的分散固相萃取方法 ...
本文在已有研究[ 23, 24, 25, 26 ]的基础上 ...
2013, Vol. 31 Issue (9): 862-868
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