固相萃取-超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时检测尿样中的麻黄碱和<em>N</em>-甲基麻黄碱


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固相萃取-超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时检测尿样中的麻黄碱和N-甲基麻黄碱

张琳¹, 张福成², 王朝虹³, 蒋晔¹ , 许萌¹, 李虹⁴

1. 河北医科大学药学院, 河北石家庄 050017;
2. 空军总医院, 北京 100142;
3. 最高人民检察院司法鉴定中心, 北京 100040;
4. 云南省公安厅刑警总队, 云南昆明 650000

收稿日期：2013-02-25

基金项目：河北省卫生厅科研基金项目(08056).

作者简介：

通讯作者：蒋晔

摘要：建立了固相萃取-超高效液相色谱-电喷雾串联质谱(SPE-UPLC-ESI MS/MS)联用方法, 定量测定尿样中的麻黄碱和N-甲基麻黄碱。样品经Oasis MCX柱提取、纯化和富集后, 采用电喷雾(ESI)离子源电离, 正离子多反应监测(MRM)模式质谱进行定性和定量分析。麻黄碱和N-甲基麻黄碱在0.0250~2.50 μg/L质量浓度范围内线性关系良好, 线性相关系数分别为0.9998和0.9992, 提取回收率高于80%, 提取效率的RSD小于5.0%, 检出限均达到0.01 μg/L, 可大大延长尿样检材中麻黄碱和N-甲基麻黄碱的检测周期。结果表明, 该方法快速、准确, 为尿液中痕量麻黄碱和N-甲基麻黄碱的分析提供了灵敏的分析方法。

关键词：固相萃取超高效液相色谱-电喷雾串联质谱麻黄碱 N-甲基麻黄碱尿

Simultaneous determination of ephedrine and N-methylephedrine in urine by solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry

ZHANG Lin¹, ZHANG Fucheng², WANG Zhaohong³, JIANG Ye¹ , XU Meng¹, LI Hong⁴

1. School of Pharmacology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China;
2. Air Force General Hospital, Beijing 100142, China;
3. Institute of Forensic Science of Supreme People's Procuratorate, Beijing 100040, China;
4. Interpol Corps of Yunnan Public Security Bureau, Kunming 650000, China

Received: 2013-02-25

Abstract: A rapid and sensitive method has been developed for the simultaneous determination of ephedrine and N-methylephedrine in urine samples by solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry (SPE-UPLC-ESI MS/MS). The samples were extracted with Oasis MCX solid phase extraction cartridges and measured in the modes of electrospray positive ionization (ESI+) and multiple reaction monitoring (MRM). Good linearities were observed in the range of 0.0250-2.50 μg/L with correlation coefficient over 0.9990 for both analytes. The recoveries were above 80% with RSDs less than 5.0%. The limits of detection were 0.01 μg/L. The method proves to be rapid and sensitive for the trace determination of ephedrine and N-methylephedrine in urine samples.

Key words: solid phase extraction (SPE) ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (UPLC-ESI MS/MS) ephedrine N-methylephedrine urine

麻黄碱和N-甲基麻黄碱具有扩张支气管、抗过敏和镇咳作用, 是感冒药中的常见成分。其中, 麻黄碱具有较强的兴奋作用^{[ 1 ]}, 是国际奥委会严格禁止的兴奋剂。因此, 体育赛事前确定运动员是否摄取该类药物时, 常需进行尿样等生物检材的检测。对于具有器质性心脏病的人员, 服用含麻黄碱的制剂还可引起意外心律紊乱而致死。此外, 二者还是制造苯丙胺类毒品的主要原料, 从吸毒人员体内采集的血样、尿样及毛发等生物检材中检测该类物质是刑侦机构立案的重要依据。因此, 建立快速、灵敏的生物样品中痕量麻黄碱分析方法, 可大大延长生物检材的检测周期, 用于追溯特殊人群的用药史, 对于药物的安全使用具有重要意义。

生物检材成分复杂而待测物含量往往较低, 因此常需对生物样品中的待测物进行提取、纯化和富集, 以提高检测灵敏度。已报道的生物样品前处理方法有稀释法^{[ 2 ]}、蛋白沉淀法^{[ 3 ]}、液相萃取法^{[ 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ]}、中空纤维液相微萃取法^{[ 12 ]}、衍生化法^{[ 13, 14, 15 ]}、超滤法^{[ 16 ]}等。但这些方法均存在一些缺点:稀释法严重污染色谱系统; 蛋白沉淀法会导致样品稀释, 检测灵敏度降低; 液相萃取操作繁琐; 衍生化法往往受到衍生化效率的限制; 中空纤维微液相萃取法的重现性较差; 而超滤法存在浓差极化现象, 导致测定结果失真。此外, 文献^{[ 17, 18, 19 ]}报道了用固相萃取-液相色谱-质联用的方法检测生物样品中的麻黄碱, 检测灵敏度为0.1～1 μ g/L, 对未及时取样且浓度极低的样品往往无法获得满意的分析结果。因此, 本文建立了固相萃取-超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法(SPE-UPLC-ESI MS/MS)联用技术同时定量测定尿样中的痕量麻黄碱和N-甲基麻黄碱。该方法能有效提取、纯化和富集待测物, 灵敏度高, 结果准确。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC超高相液相色谱仪, Xevo TQ-MS串联四极杆质谱仪和Masslynx^TM工作站(美国Waters公司)。Milli-Q超纯水制造系统(美国Millipore公司); 固相萃取仪(美国Waters公司), Oasis HLB和Oasis MCX固相萃取柱(1 mL, 30 mg; 美国Waters公司)。

盐酸麻黄碱(批号:171241-200404)和盐酸甲基麻黄碱(批号:171247-200301)对照品购于中国药品生物制品检定所, 纯度均大于99.5% ; 甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯, 水为超纯水, 其他试剂均为分析纯。

1.2 尿样前处理

尿样采自健康受试志愿者。精密吸取4 mL尿液置于离心管中, 加入200 μ L 5 mol/L 盐酸溶液酸化, 在离心力 8000 g条件下离心5 min。取上清液过MCX固相萃取柱(预先分别用1 mL甲醇和1 mL水活化、平衡), 依次用1 mL 0.1 mol/L 盐酸溶液、1 mL甲醇和1 mL 5%(体积百分数, 下同)氨水溶液淋洗, 用1 mL甲醇-氨水(95 ∶ 5, v/v)溶液洗脱, 接收洗脱液, 待UPLC-ESI MS/MS分析。

1.3 色谱与质谱条件

ACQUITY UPLC BEH Phenyl色谱柱(10 cm×2.1 mm, 1.7 μ m); 流动相A为乙腈, 流动相B为0.3%甲酸溶液。洗脱梯度：0～3 min，流动相A比例由10%升至55% , 4 min时升至90% , 4.1 min降至10% , 保持1.9 min。流速:0.4 mL/min; 柱温:35 ℃; 样品室温度:10 ℃; 进样体积:2 μ L。

电喷雾离子源正离子扫描, 多反应监测模式; 毛细管电压:3.0 kV; 离子源温度:300 ℃; 去溶剂温度:500 ℃, 去溶剂气流量:1000 L/h; 锥孔气流量:30 L/h; 碰撞气流量:0.15 mL/min。待测物的监测离子及驻留时间、锥孔电压、碰撞电压等参数见表1。

表1 麻黄碱和N-甲基麻黄碱的质谱参数 Table 1 MS/MS parameters of ephedrine and N-methylephedrine

2 结果与讨论

2.1 系统适用性试验

在1.3节的条件下, 混合对照品溶液、空白尿样和口服急支糖浆制剂7 d后的尿样分别经Oasis MCX固相萃取后的UPLC-MS/MS谱图见图1。空白尿样中不含待测物, 且空白基质对待测物的测定无干扰。

图1 (a)混合对照品溶液(1 μ g/L)、(b)空白尿样和(c)口服急支糖浆制剂7 d后的分别经MCX柱固相萃取后的UPLC-MS/MS定性和定量离子流谱图 Fig.1 UPLC-MS/MS qualitative and quantitative ion current chromatograms of (a) mixed standard solution (1 μ g/L), (b) human blank urine, and (c) urine after 7 d administering Jizhi Syrup extracted by MCX solid phase extraction * quantitative ion.

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱的选择

近年来, 采用离子对色谱法分析检测生物碱的报道较多^{[ 17 ]}, 但这给质谱检测带来困难。本文在酸性流动相(流动相B为0.1%甲酸溶液)条件下, 分别考察了HSS SB(5 cm)、BEH C₁₈(10 cm)、CSH C₁₈(5 cm)、BEH Phenyl(10 cm)4种色谱柱(柱内径均为2.1 mm, 填料粒径均为1.7 μ m)对待测物灵敏度和分离度的影响(见图2)。结果表明, 以BEH Phenyl色谱柱为分离柱时, 待测物的灵敏度较高, 且分离度较好。

图2 不同色谱柱对待测物灵敏度的影响 Fig.2 Effect of different chromatographic columns on the sensitivity of the analytes

2.2.2 流动相的选择

以BEH Phenyl色谱柱作为分离柱, 分别考察了酸性流动相(流动相B为0.1%甲酸溶液)和碱性流动相(流动相B为10 mmol/L 碳酸氢铵溶液, pH 10)对待测物灵敏度及峰形的影响(见图3)。结果表明, 待测物在酸性流动相下的灵敏度略高于碱性流动相, 最终选择酸性流动相。

图3 不同流动相对待测物灵敏度的影响 Fig.3 Effect of different mobile phases on the sensitivity of analytes

图4 不同甲酸浓度对待测物灵敏度的影响 Fig.4 Effect of different volume percentages of formic acid on the sensitivity of analytes

2.2.3 甲酸浓度的选择

酸性流动相中甲酸的浓度不同, 对待测物灵敏度及峰形有不同程度的影响, 因此以BEH Phenyl色谱柱作为分离柱, 分别考察了0.1%甲酸溶液和0.3%甲酸溶液作为流动相对待测物灵敏度的影响(见图4)。结果表明, 以0.3%甲酸水溶液作为流动相时, 待测物的灵敏度较高, 且峰形较好, 最终选择在酸性流动相中添加0.3%的甲酸。

2.3 样品前处理条件的选择

表2 Oasis HLB与Oasis MCX固相萃取柱萃取效果的比较(n=6) Table 2 Comparison of the extraction efficiencies of Oasis HLB and Oasis MCX SPE columns (n=6)

2.3.1 固相萃取柱的选择

由于待测组分呈碱性, 在反相色谱填料上的保留很弱, 因此很难利用一般的固相萃取小柱达到萃取的目的。本文考察了含有吸附性填料的Oasis HLB固相萃取柱和兼具离子交换和反相保留的Oasis MCX固相萃取柱对样品的提取净化效果。在不含待测物的空白尿中分别添加 0.0250、0.250和2.50 μ g/L 的混合标准溶液, 按1.2节的方法处理样品, 在1.3节的条件下进行测定, 比较样品的基质效应(见表2)。

结果表明, HLB柱作为萃取柱会产生严重的离子抑制效应, 影响检测灵敏度和准确度, 故选择MCX柱作为固相萃取柱。

2.3.2 洗脱条件的选择

为了使待测物在固相萃取柱上得到最好的保留, 上样前需要对样品进行酸化以保证待测组分的完全离子化。试验表明, 4 mL尿液中加入200 μ L 5 mol/L 的盐酸溶液可保证待测组分完全吸附在填料上。尿液等生物样品基质非常复杂, 采用质谱检测时基质效应对检测结果的准确性影响很大。为了尽可能地去除基质, 本实验采用酸洗、醇洗和碱洗三步清洗, 选择性除去非极性的中性物质、酸性以及极性碱性干扰物, 最后采用碱性的甲醇溶液进行洗脱。考察了不同比例的甲醇-氨水溶液的洗脱能力。结果表明, 以甲醇-氨水(95 ∶ 5, v/v)溶液作为洗脱液时, 待测物的回收率最高, 故选择其作为洗脱液。

2.4 线性范围和检出限

配制麻黄碱和N-甲基麻黄碱质量浓度为1、2、5、10、20、50、100 μ g/L 的混合对照品溶液和内标氘代苯丙胺质量浓度为10 μ g/L 的对照品溶液。吸取上述系列浓度对照品溶液各250 μ L至7个离心管中, 分别加入250 μ L内标溶液, 最后用空白尿稀释至10 mL, 配制成质量浓度分别为 0.0250、0.0500、0.125、0.250、0.500、1.25、2.50 μ g/L 的样品溶液。按1.2节的方法处理样品, 按1.3节的条件进样测定, 记录峰面积。以待测物与内标峰面积比(Y)对质量浓度(C, μ g/L)进行线性回归, 得到麻黄碱和N-甲基麻黄碱在 0.0250～2.50 μ g/L 质量浓度范围内的线性方程分别为Y=8.12C-0.143(r=0.9998)和Y=4.09C+0.735(r=0.9992)。取线性最低点溶液逐倍稀释, 按1.3节的条件进样测定, 得麻黄碱和N-甲基麻黄碱的检出限均为0.01 μ g/L(S/N=3), 均高于文献^{[5-7, 12, 14-17, 19]}报道。

2.5 精密度、准确度、基质效应及提取回收率

配制麻黄碱和N-甲基麻黄碱低、中、高3个浓度分别为 0.0250、0.250和2.50 μ g/L 的质控(QC)样品, 每个浓度6份, 按1.2节的方法处理样品, 在1.3节的条件下进行测定, 记录峰面积A_s, 计算日内精密度和准确度; 连续测定3 d, 计算日间精密度。同时, 取空白尿, 按1.2节的方法处理后, 配制成低、中、高3个浓度的溶液, 每个浓度6份, 在1.3节的条件下进行测定, 记录峰面积A_m; 另取上述3个浓度的对照品溶液, 不经萃取直接进样, 记录峰面积为A_std。以A_s/A_m计算提取回收率, A_m/A_std计算基质效应, 结果见表3。

表3 不同洗脱液洗脱能力的比较 Table 3 Comparison of elution abilities of different eluents

2.6 样品稳定性

配制麻黄碱和N-甲基麻黄碱低、中、高3个质量浓度分别为 0.0250、0.250和2.50 μ g/L 的质控样品, 每个浓度3份。将上述样品于室温放置24 h及经过3次冻融循环后, 按1.2节方法处理, 并在1.3节的条件下进行测定, 考察其短期稳定性及冻融稳定性(见表4)。结果表明, 麻黄碱和N-甲基麻黄碱在上述条件下均稳定。

表4 麻黄碱和N-甲基麻黄碱的稳定性(n=3) Table 4 Stabilities of ephedrine and N-methylephedrine (n=3)

2.7 真实样品测定

采集健康志愿者口服10 mL急支糖浆制剂7 d后的尿样, 按1.2节方法处理样品, 并按1.3节的条件进行测定, 尿样中麻黄碱和N-甲基麻黄碱的质量浓度分别为0.034和0.137 μ g/L。表明该方法能够有效测定尿样中痕量的麻黄碱和N-甲基麻黄碱, 大大提高检测灵敏度, 并延长了尿样中麻黄碱和N-甲基麻黄碱的检测周期。

3 结论

本实验采用Oasis MCX固相萃取柱对尿样进行提取、纯化和富集, 建立了SPE-UPLC-ESI MS/MS方法分析尿样中痕量麻黄碱和N-甲基麻黄碱, 显著提高了检测灵敏度, 大大延长了尿样中麻黄碱和N-甲基麻黄碱的检测周期, 为未及时取样且浓度极低的样品中痕量麻黄碱和N-甲基麻黄碱的检测提供了有效的方法。

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本文献在全文中的定位：

... 麻黄碱具有较强的兴奋作用^{[ 1 ]} ...

本文献在全文中的定位：

... 已报道的生物样品前处理方法有稀释法^{[ 2 ]}、蛋白沉淀法^{[ 3 ]}、液相萃取法^{[ 4 ...}

本文献在全文中的定位：

... 已报道的生物样品前处理方法有稀释法^{[ 2 ]}、蛋白沉淀法^{[ 3 ]}、液相萃取法^{[ 4 ...}

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... 已报道的生物样品前处理方法有稀释法^{[ 2 ]}、蛋白沉淀法^{[ 3 ]}、液相萃取法^{[ 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ]}、中空纤维液相微萃取法^{[ 12 ]}、衍生化法^{[ 13 ...}

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... 11 ]、中空纤维液相微萃取法^{[ 12 ]}、衍生化法^{[ 13 ...}

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... 11 ]、中空纤维液相微萃取法^{[ 12 ]}、衍生化法^{[ 13, 14, 15 ]}、超滤法^{[ 16 ]}等 ...

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... 11 ]、中空纤维液相微萃取法^{[ 12 ]}、衍生化法^{[ 13, 14, 15 ]}、超滤法^{[ 16 ]}等 ...

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... 11 ]、中空纤维液相微萃取法^{[ 12 ]}、衍生化法^{[ 13, 14, 15 ]}、超滤法^{[ 16 ]}等 ...

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... 15 ]、超滤法^{[ 16 ]}等 ...

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... 文献^{[ 17, 18, 19 ]}报道了用固相萃取-液相色谱-质联用的方法检测生物样品中的麻黄碱 ...

... 采用离子对色谱法分析检测生物碱的报道较多^{[ 17 ]} ...

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