近年来频繁爆发一系列食品安全问题, 如三聚氰胺奶粉事件、瘦肉精事件以及最近的白酒塑化剂事件等, 使得食品安全问题受到社会的强烈关注, 如何快速高效地检测食品中可能存在的有害物质也成为研究的热点。本文以自制的DVB-DVP为SPE填料, 结合高效液相色谱法, 将其应用于白酒中邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯3种塑化剂残留量的分析。并对DVB-NVP进行磺酸化修饰, 得到强阳离子交换SPE填料(DVB-NVP-SO3H), 结合高效液相色谱法, 对猪肉中的可乐定和赛庚啶残留量进行分析。
Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司); 环境扫描电子显微镜(XL30ESEM, 荷兰飞利浦公司); 高效液相色谱仪(自组装):色谱泵(Consta Metric 3000, 美国米顿罗公司), 检测器(Spectro Monitor 3200, 美国热电公司), 色谱工作站(ChromPerfect, 美国Justice Innovation), 3 mL、6 mL聚丙烯SPE柱管、聚四氟乙烯(PTFE)挡板、玻璃毡、无定形硅胶键合C18型SPE柱(60 mg/3 mL, 天津奥顺达科技有限公司), 5 mL全玻璃SPE柱管(上海医疗器械有限公司), Oasis HLB SPE小柱(60 mg/3 mL, 美国Waters公司)
甲醇、甲苯、乙腈、偶氮二异丁腈(AIBN)、氢氧化钠、甲酸、磷酸二氢钠、磷酸、浓硫酸、浓盐酸、乙酸铵、萘(江天化工有限公司), 二乙烯苯(含量大于80% , 山东嘉龙化工有限公司), N-乙烯基吡咯烷酮(含量大于99.9% , 博爱新开源制药有限公司), 羟丙甲基纤维素(医用，国药集团化学试剂有限公司), 正十二烷、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯(天津科密欧化学试剂有限公司), 对乙酰氨基酚(北京曙光药业责任有限公司), 雷尼替丁(天津太平洋制药有限公司)、普萘洛尔(大同市云岗制药有限公司)、诺氟沙星(天津金虹胜利药业有限公司)、卡马西平(上海复旦复华药业有限公司)。可乐定、赛庚啶(中国药品生物制品检定所)。猪肉(购于天津大学四季村菜市场), 红星二锅头(56度, 北京红星股份有限公司)。
取75 mL蒸馏水至250 mL三口烧瓶中, 加入 0.3750 g羟丙甲基纤维素粉末, 充分搅拌溶解, 作为分散相备用。精密量取18 mL甲苯、3.1 mL正十二烷、8 mL N-乙烯吡咯烷酮和13 mL二乙烯苯至小烧杯中, 加入 0.1388 g AIBN, 混匀后倒入三口烧瓶中, 快速搅拌30 min, 加热至70 ℃, 冷凝回流搅拌反应12 h后停止反应, 用水和甲醇清洗产物, 于80 ℃下真空干燥12 h, 得DVB-NVP微球。
精密称定1 g DVB-NVP微球至50 mL烧瓶中, 加入10 mL 1, 2-二氯甲烷溶胀2 h, 随后缓慢加入10 mL浓硫酸, 于80 ℃回流反应9 h, 抽滤, 产物用去离子水洗至中性, 于80 ℃真空干燥至恒重, 得到强阳离子交换DVB-NVP-SO3H填料。取一定量该填料与过量的NaOH反应, 用HCl滴定剩余的NaOH, 得到磺酸化填料的离子交换容量。
将自制DVB-NVP填料制成60 mg/3 mL的SPE小柱, 选取极性的对乙酰氨基酚和雷尼替丁、中等极性的普萘洛尔和诺氟沙星以及非极性的卡马西平和萘的回收率为评价指标, 考察自制DVB-NVP填料的性能。同时, 将之与相同规格的商品化硅胶键合C18 SPE柱和Oasis HLB SPE柱对比。
所有SPE柱分别用3 mL甲醇、3 mL水平衡, 然后上样2 mL, 用3 mL 5% (v/v)甲醇水溶液淋洗, 最后用一定体积(见表1)的甲醇洗脱, 定容, 用HPLC外标法进行定量, 得到自制DVB-NVP填料对每种化合物的回收率, 并与商品化C18 SPE柱和Oasis HLB SPE柱所得的回收率对比。
液相色谱条件:自组装高效液相色谱仪; 天津奥顺达科技有限公司BauloTM牌奔腾C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m); 流速1.0 mL/min; 室温; 进样20 μ L; 其余条件见表1。
称取500 mg DVB-NVP装填在6 mL玻璃柱管中, 上下分别用玻璃毡和滤纸进行支撑。同法制得6支DVB-NVP SPE柱, 其中1支用于处理空白溶液。
取22.3 mL白酒, 用去离子水定容至250 mL, 得酒精含量为5%(v/v)的水溶液, 用此溶液配制质量浓度为0.5 mg/L 的塑化剂样品液和空白液。
SPE柱经5 mL乙腈、5 mL水活化平衡后, 取10 mL样品液/空白液上样, 用5 mL水淋洗, 5 mL乙腈洗脱, HPLC外标法进行定量, 计算回收率。
液相色谱条件:安捷伦1100高效液相色谱仪; 天津奥顺达科技有限公司BauloTM牌奔腾C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m); 流速为1.0 mL/min; 进样量为20 μ L; 流动相为乙腈-水(75 ∶ 25, v/v); 检测波长为238 nm。
称取500 mg DVB-NVP-SO3H至6 mL玻璃柱管中, 上下分别用聚丙烯挡板进行支撑, 得到规格为500 mg/6 mL的DVB-NVP-SO3H SPE柱。
盐酸甲醇溶液的配制:取0.1 mol/L 盐酸20 mL, 加入甲醇80 mL混匀, 即得; 0.2%甲酸乙腈水溶液的配制:取0.25%甲酸溶液80 mL至100 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容, 即得; 样品处理过程:称取2 g绞碎的猪肉于50 mL离心管中, 加入20 mL盐酸甲醇溶液、300 μ L质量浓度均为1 g/L 的可乐定和赛庚啶混合液, 涡旋20 min, 于12000 r/min 下离心10 min, 取上清液, 用盐酸甲醇溶液稀释1倍, 得样品液。
SPE柱经5 mL甲醇、5 mL水活化平衡后, 取2 mL样品液上样, 用2 mL水和2 mL甲醇淋洗, 10 mL 5%的氨化甲醇洗脱, 收集洗脱液, 吹干, 用1 mL 0.2%甲酸乙腈溶液复溶, HPLC外标法进行定量, 计算可乐定和赛庚啶的回收率。
标准工作曲线：根据质量浓度为30 mg/L 的混合液不同的进样体积与对应的峰面积计算得到。
液相色谱条件:安捷伦1100高效液相色谱仪; 天津奥顺达科技有限公司BauloTMBIO-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m); 流速为1.0 mL/min; 进样量为20 μ L; 流动相:A相为乙腈, B相为0.2%甲酸水溶液; 洗脱程序:0～3 min由20%A线性变化至50%A, 3～5 min由50%A线性变化至80%A, 5～6 min由80%A线性变化至50%A, 6～7 min由50%A线性变化至20%A; 检测波长为276 nm。
固相萃取过程对填料的粒径大小有一定的要求。一般待测样品溶液是在重力作用下通过固相萃取柱, 因此流速主要受粒径大小的影响:粒径太小，流速较慢, 延长了分析时间, 不符合SPE快速分析的特点; 粒径过大, 样品流速过快, 与填料的作用时间不充分, 导致回收率较低。通常要求固相萃取填料的粒径在20～60 μ m之间, 此时能够保证填料具有一定的均一性以及溶液能够以合适的流速通过SPE柱。微米级高分子的合成方法一般有悬浮聚合法和种子溶胀法, 种子溶胀法步骤繁琐, 耗时较长, 且消耗的溶剂量较大。本文选择悬浮聚合法合成微球, 得到的产物粒径主要分布在20～60 μ m之间, 图1是用环境扫描电子显微镜观察得到的DVB-NVP微球图片, 由此可以看出, 该球具有良好的球形度和分散性, 符合固相萃取对固定相的要求。在1.2节中DVB-NVP合成的条件下进行了多次重复实验, 结果表明实验的重现性良好。
传统的以硅胶为基质键合C18的吸附剂是使用比较广泛的固相萃取材料。它主要是通过非极性力与化合物发生作用, 适用于中等极性及非极性化合物的分析。DVB-NVP由于具有疏水的苯环及亲水的吡咯环, 能够与芳香环化合物发生 π - π 作用, 也能与极性化合物产生分子间作用力, 故比C18的使用范围更广, 既可用于极性化合物的分析又适用于非极性化合物的分析。本文在成功制备DVB-NVP填料的基础上, 通过检测其对不同极性化合物的回收率, 并与商品化C18和HLB对比, 评价其性能。
实验结果表明, 对乙酰氨基酚、雷尼替丁、普萘洛尔、诺氟沙星、卡马西平和萘在本文所考察浓度范围内均与峰面积呈良好的线性关系, 其分子结构式、线性回归方程及相关系数见表2, 测定结果见表3。结果表明:除对乙酰氨基酚外, C18对5种化合物的回收率在94.16% ～101.93%之间, 对乙酰氨基酚由于苯环上酚羟基及酰胺键的存在, 具有较强的极性, 因此C18对对乙酰氨基酚几乎没有保留, 回收率仅为1.19% , 而DVB-NVP上的吡咯环可以与对酚羟基及酰胺键发生作用, 因此具有较高的回收率; 雷尼替丁、普萘洛尔、诺氟沙星、卡马西平分子内既含有极性的基团, 又含有非极性的基团, 与DVB-NVP基质有双重的作用力, 因此DVB-NVP对这4种化合物的回收率均较高, 且高于C18填料。萘的分子内含芳香环, 可以与C18和DVB-NVP产生非极性作用, 3种填料对其均有较高的回收率。
通过对不同极性的6种模型化合物的分析结果表明, 自制的DVB-NVP对不同极性的化合物具有较高的回收率, 回收率在95.55% ～101.08%之间, 与商品化的DVB-NVP相当(商品化的DVB-NVP对以上6种模型化合物的回收率在98.01% ～101.59%之间)；DVB-NVP适合于极性到非极性化合物的分析; 而C18对极性化合物的回收率较低, 不适合于极性化合物的分析。
增塑剂, 又称塑化剂, 是工业上被广泛使用的高分子材料助剂, 在塑料加工中添加这种物质, 可以使其柔韧性增强, 容易加工, 可合法用于工业用途。邻苯二甲酸酯(也叫酞酸酯)增塑剂由于在人体内具有类似雌性激素的作用, 且具有生物累积性, 可导致人体生殖功能下降和生殖器官畸形[ 14, 15, 16 ]。2011年6月1日卫生部紧急发布公告, 将邻苯二甲酸酯类物质列入食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单。2012年11月19日, 酒鬼酒公司被曝塑化剂含量超标260% 。目前并没有针对白酒中塑化剂残留量的标准检测方法, 只有食品塑料包装材料中邻苯二甲酸酯类化合物的标准检测方法[ 17 ], 因此, 开发白酒中塑化剂的检测方法迫在眉睫。本实验使用自制的DVB-NVP固相萃取填料, 与HPLC联用分析了白酒中邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯3种塑化剂的残留量。
分析结果表明, 3种塑化剂的检出限分别为0.05、0.07和0.15 mg/L, 定量限分别为0.15、0.20和0.49 mg/L。3种塑化剂在0.5～1.7 mg/L 范围内质量浓度与峰面积呈良好的线性关系, 线性回归方程及分析结果见表4。由表4结果可以知道, DVB-NVP对3种塑化剂的回收率在102.11% ～102.99%之间, 相对标准偏差小于3% , 符合实际分析要求, 能够用于白酒中塑化剂的残留检测。
可乐定是一种抗高血压药物, 对动物具有促进生长及增重的作用[ 18, 19 ]; 赛庚啶是一种抗组胺药, 具有明显的抗胆碱和中枢抑制作用, 可以增进食欲[ 20 ]。食用含有可乐定和赛庚啶残留的动物源性产品对人体健康具有一定的危害性, 目前国内只有针对饲料中这两种化合物的标准检测方法[ 21 ], 而针对动物组织中两种药物残留的相应检测方法和限制标准未见研究报道, 由此造成了食品安全监测的盲区。可乐定和赛庚啶属于碱性化合物, 能够与阳离子交换填料以离子键相互作用而保留在填料上；使用碱性溶剂可使其转换为分子形式, 进而从SPE柱上洗脱下来。本文将DVB-NVP进行磺酸化修饰, 得到强阳离子交换填料, 应用这种离子交换吸附剂, 结合高效液相色谱法, 对猪肉中可乐定和赛庚啶的残留量进行了分析。
磺化反应发生在聚合物的苯环结构上, 反应式见图2。以1, 2-二氯乙烷作为反应溶剂, 可以使聚合物微球发生溶胀, 有利于硫酸分子进入聚合物网状结构与之发生反应, 提高磺酸基的键合量。磺酸化的程度在一定范围内与浓硫酸的量、磺酸化温度、磺酸化时间成正比, 因此可以根据实际需要, 选择合 适的磺酸化反应条件得到不同离子交换容量的微
分析结果表明, 可乐定和赛庚啶的检出限分别为0.70 mg/L 和0.15 mg/L, 定量限分别为2.5 mg/L 和0.4 mg/L, 质量浓度为30 mg/L 的可乐定和赛庚啶在进样体积为6～34 μ L范围内进样质量与峰面积呈良好的线性关系, 线性回归方程及分析结果见表5。DVB-NVP-SO3H对可乐定和赛庚啶的回收率分别为89.23% ～91.42% , 其RSD小于15% 。符合生物样品分析的要求, 能够用于猪肉中可乐定和赛庚啶残留量的检测。
本文成功合成了一种亲水-亲油平衡的新型固相萃取填料, 通过对其吸附性能的考察, 得知其对不同极性的化合物有很好的吸附效果, 优于传统的C18键合硅胶填料, 能够与商品化的同类型填料相媲美。同时, 将其运用到食品安全分析中, 如白酒中3种塑化剂的分析, 结果表明, 所建立的塑化剂检测方法稳定、可靠、灵敏度高, 回收率好, 可以作为白酒中塑化剂检测的前处理填料; 另外, 本文成功地将磺酸化的DVB-NVP填料用于猪肉中可乐定和赛庚啶的分析中, 并建立了二者高效、灵敏、回收率高的检测方法。综上所述, DVB-NVP为基质的填料具有广泛的应用前景。
2013, Vol. 31 Issue (9): 825-830
PDF (1242KB)
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