Agilent 1100系列高效液相色谱仪(包括真空溶剂脱气机、四元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列(DAD)紫外检测器)。

质谱分析在一部Acquity纳升级液相色谱系统(Waters, Milford, MA,美国)与一台纳升电喷雾-四极杆-飞行时间质谱系统联用仪器(Waters MS Technologies, Manchester,英国)上开展。离子模式为正离子模式,质谱分析方法详见我们之前的报道^{[ 9 ]}。

乙腈(质谱级)和甲酸(色谱级)分别购自Merck公司(Darmstadt,德国)和Acros公司(New Jersey,美国)。甲酸铵购自Tedia公司(Fairfield,美国)。磷酸苯二钠购自Acros公司(New Jersey,美国)。 α -酪蛋白和碳酸氢铵均购自Sigma-Aldrich公司(St. Louis, MO)。氨水购自Fluka公司(St. Louis, MO)。质谱序列级别胰蛋白酶购自Promega公司(Madison, WI)。水采用Millipore水处理系统进行纯化(Millipore, Bedford, MA)。GELoader小柱购自Eppendorf公司(Hamburg,德国)。

Click OEG-CD材料为实验室自制材料(材料合成方法见文献^{[ 9 ]}), ZipTip C18购自Millipore公司(Bedford, MA,美国)。

色谱柱为Click OEG-CD (100 mm×2.1 mm, 5 μ m,实验室自制)。流动相条件:有机相为纯乙腈,水相为不同pH的甲酸水溶液。柱温设为30 ℃,流速设为0.2 mL/min。检测波长为280 nm。死时间按照第一个基线波动测试,为0.910 min。

磷酸化肽富集在GELoader吸头中进行,每个GELoader吸头均装填有1.5 mg Click OEG-CD材料。86 pmol α -酪蛋白酶解液(样品制备方法见文献^{[ 11 ]})上样后,依次用90%(体积分数,下同)乙腈/甲酸水溶液(pH=2, 4, 6), 80%乙腈/甲酸水溶液(pH=2, 4, 6), 70%乙腈/甲酸水溶液(pH=2, 4, 6), 50%乙腈/甲酸水溶液(pH=2, 4, 6)各20 μ L进行洗脱,收集洗脱液,取5 μ L进入质谱进行分析。

Click OEG-CD材料由于表面具有三唑环,能够提供弱阴离子交换作用,因此能够选择性地保留酸性化合物。由于酸性化合物在不同的pH环境下电离程度有较大差异,当流动相pH值高于酸性化合物的pK_a时,酸性化合物呈现离子状态,能够与Click OEG-CD材料发生阴离子交换作用而保留;当流动相pH值低于酸性化合物的pK_a时,酸性化合物呈现分子状态,不能基于阴离子交换作用而保留。由于酸性化合物在Click OEG-CD材料上的保留是基于多种作用力,如疏水作用力、氢键作用力、离子交换作用力等,因此优化分离条件有助于调节化合物与材料的作用力,从而提高分离选择性。

本研究选择磷酸苯二钠作为模型样品,考察在两种pH值(pH=2, 4)条件下,流动相中的乙腈含量与化合物在材料上的保留因子的关系。该化合物带有磷酸根,流动相pH值对磷酸苯二钠在Click OEG-CD材料上的保留影响考察结果对优化磷酸化肽富集条件有一定的借鉴意义。从图1可以看出,当流动相中的乙腈含量从10%上升到90%时(pH=2),磷酸苯二钠的保留因子也逐渐增大,这是由Click OEG-CD固定相对极性化合物的保留特性决定的^{[ 12 ]}。当流动相pH值为2时,5种乙腈含量条件下磷酸苯二钠的保留均弱于流动相pH为4时的保留。这是因为磷酸根在酸性条件下电离的pK_a值为2.1,也就是说当流动相的pH值小于2.1时,磷酸根不会发生电离,也就不会与材料发生离子交换作用,磷酸苯二钠在色谱柱上的保留仅取决于疏水作用力或者氢键作用力,因此保留较弱。

图1

Fig. 1

图1 流动相pH值不同时流动相中乙腈含量对磷酸苯二钠在Click OEG-CD色谱柱上保留因子的影响 Fig.1 Influence of acetonitrile content on the retention factor of disodium phenyl phosphate on Click OEG-CD column under different pH values of mobile phase

结果表明:酸性物质在Click OEG-CD上的保留是基于多种作用力,流动相pH值对化合物在材料上的保留存在较明显的影响,有必要在实验过程中优化流动相的pH值。

通过以上研究结果,流动相pH值对磷酸根的电离会产生影响。磷酸化肽由于带有一个或多个磷酸根,其在Click OEG-CD材料上的富集选择性也会受到流动相pH值的影响。 本研究选择 α -酪蛋白的酶解液为研究对象,考察流动相pH值对亲水模式下磷酸化肽在Click OEG-CD材料上富集选择性的影响。 α -酪蛋白的酶解液中含有多种肽,包括磷酸化肽、多磷酸化肽和非磷酸化肽,选择这种考察对象对于实际样品分析有一定的指导意义。为了方便比较,所考察的3种富集洗脱条件差异仅在于流动相的pH值不同(分别为2、4、6)。

流动相pH值为2时磷酸化肽富集的结果如图2所示, α -酪蛋白的酶解液在Click OEG-CD材料上富集后,用90%乙腈/甲酸水溶液洗脱的组分中已经有磷酸化肽出现,比如P1(m/z 830.97(2+),氨基酸序列为VPQLEIVPNpSAEER), P2(m/z 733.88(2+),氨基酸序列为TVDMEpSTEVFTK)和P3(m/z 976.58(2+),氨基酸序列为YKVPQLEIVPNpSAEER)3种磷酸化肽,许多酸性非磷酸化肽(如m/z 880.5533(2+)和m/z 1158.6665(2+))也出现在这个组分中(图2a)。此外,从各个组分的离子强度来看,90%乙腈/甲酸水溶液洗脱组分的质谱信号也最高(4.24×10⁴)。说明在此流动相pH条件下,磷酸化肽上的磷酸根不能发生电离,不能发生阴离子交换作用力富集,在Click OEG-CD材料上保留较弱,因此出现在90%乙腈/甲酸水溶液洗脱组分中。用80%乙腈/甲酸水溶液洗脱的组分中也有磷酸化肽的信号,相较于90%乙腈/甲酸水溶液洗脱的组分,磷酸化肽P1与酸性非磷酸化肽(m/z 880.5533(2+))的丰度比有所下降(90%乙腈/甲酸水组分丰度比大于1, 80%乙腈/甲酸水组分丰度比小于1)(图2a, b)。这是因为磷酸化肽的酸性更强,在pH=2条件下无法电离,在材料上的保留更弱。用50%乙腈/甲酸水溶液洗脱的组分中出现一种带有两个磷酸根的磷酸化肽P4(m/z 964.45(2+),氨基酸序列为DIGpSEpSTEDQAMEDIK)(图2d)。这种磷酸化肽通常丰度较低,容易被高丰度的磷酸化肽或非磷酸化肽信号所掩盖,P4出现在50%乙腈/甲酸水溶液洗脱的组分中是由于其他高丰度的对应物已经在前面的洗脱组分中除去了,离子抑制效应有效降低。

图2

Fig. 2

图2 流动相pH=2时亲水模式中不同乙腈浓度下Click OEG-CD材料对 α -酪蛋白酶解液的富集结果 Fig.2 MS spectra of elution fractions from Click OEG-CD taking digest of α -casein as test sample under HILIC mode (pH=2) with different acetonitrile contents of mobile phase a. 90% ACN; b. 80% ACN; c. 70% ACN; d. 50% ACN.

图3

Fig. 3

图3 流动相pH=4时亲水模式中不同乙腈浓度下采用Click OEG-CD材料对 α -酪蛋白酶解液富集的结果 Fig.3 MS spectra of elution fractions from Click OEG-CD taking digest of α -casein as test sample under HILIC mode (pH=4) with different acetonitrile contents of mobile phase a. 90% ACN; b. 80% ACN; c. 70% ACN; d. 50% ACN.

流动相pH值为4时磷酸化肽富集的结果如图3所示, α -酪蛋白的酶解液在Click OEG-CD材料上富集后,50%乙腈/甲酸水溶液洗脱组分中离子信号强度最高,并且两个高丰度磷酸化肽P1和P2均没有在90%乙腈/甲酸水溶液洗脱组分中出现(图3)。说明在此pH条件下,磷酸化肽能够被电离,并且由于阴离子交换作用在Click OEG-CD材料上得到富集。高丰度非磷酸化肽(m/z 748.43(1+)、980.08(2+))能够在80%乙腈/甲酸水溶液洗脱条件下去除。另外,从离子丰度来看,50%乙腈/甲酸水溶液洗脱条件下离子丰度最高(4.15×10⁴)。结果说明:磷酸化肽在pH为4的流动相、低含水量洗脱液条件下得到选择性富集,而在高含水量洗脱液条件下得到洗脱,并且采用本条件的洗脱窗口较窄,此pH值条件适合磷酸化肽富集。

流动相pH为6时磷酸化肽富集的结果如图4所示, α -酪蛋白的酶解液在Click OEG-CD材料上富集后,用90%乙腈/甲酸水溶液洗脱去除杂质,磷酸化肽在此条件下能够电离,因此能够基于阴离子交换作用和氢键作用力富集在材料表面。一些高丰度非磷酸化肽(m/z 748.45(1+))主要出现在90%和80%乙腈/甲酸水溶液的洗脱组分中(图4a和b)。两种磷酸化肽P1和P2在80% 、70% 、50%乙腈/甲酸水溶液的洗脱组分中均出现。其中70%和50%乙腈/甲酸水溶液两个洗脱组分的离子强度差别不大(分别为3.72×10⁴和2.53×10⁴)。结果说明:虽然磷酸化肽在此pH条件下能够选择性富集在Click OEG-CD材料上,但是洗脱窗口较宽,不利于高效富集方法的开展。

图4

Fig. 4

图4 流动相pH=6时亲水模式中不同乙腈浓度下采用Click OEG-CD材料对 α -酪蛋白酶解液富集的结果 Fig.4 MS spectra of elution fractions from Click OEG-CD taking digest of α -casein as test sample under HILIC mode (pH=6) with different acetonitrile contents of mobile phase a. 90% ACN; b. 80% ACN; c. 70% ACN; d. 50% ACN.