LC-10ATVP高效液相色谱仪(日本岛津公司), 包括SPD-M10Avp二极管阵列检测器(DAD)和CLASS-VP工作站; UV-2550紫外分光光度计(日本岛津公司); AUW120D十万分之一电子分析天平(日本岛津公司); DELTA-320型酸度计(梅特勒-托利多仪器有限公司); 超纯化水机(重庆颐洋企业发展有限公司)。
甘草酸单铵盐对照品(中国食品药品检定研究院, 批号:Y0000433)、18 α -Gly对照品(ALPS制药, 批号:10B001S)、18 β -Gly对照品(ALPS制药, 批号:05C11S)、有关物质A对照品(ALPS制药, 批号:10B002S)、有关物质B对照品(ALPS制药, 批号:10B003S), 以上对照品纯度均高于99% ; 甘草酸单铵盐原料药(A厂, 批号:V150860001; B厂, 批号:06802N130; C厂, 批号:11C8、10E4; D厂, 批号:09120061)。高氯酸铵、氨水、高氯酸、冰醋酸、三乙胺、磷酸均为分析纯。甲醇、乙腈为色谱纯(天津市康科德科技有限公司)。水为二次去离子水。
对照品溶液:精密称定各对照品适量, 分别置于100 mL容量瓶中, 加入50%甲醇水溶液溶解并定容, 分别制成质量浓度为 1000 mg/L 的对照品储备液, 于4 ℃冰箱中保存。精密量取5 mL对照品储备液, 置于100 mL容量瓶中, 用流动相定容, 摇匀, 作为对照品溶液。
供试品溶液:精密称定各原料药适量, 分别置于100 mL容量瓶中, 加入50%甲醇水溶液溶解并定容, 分别制成质量浓度为 1000 mg/L 的供试品储备液, 于4 ℃冰箱中保存。精密量取5 mL供试品储备液, 置于100 mL容量瓶中, 用流动相定容, 摇匀, 作为供试品溶液。
混合对照品溶液:分别精密量取18 α -Gly、18 β -Gly、有关物质A和有关物质B对照品储备液适量, 置于同一容量瓶中, 用流动相定容, 摇匀, 作为混合对照品溶液。
专属性试验测试液:精密量取供试品储备液(C厂, 批号:11C8)5 mL, 加入6 mol/L NaOH溶液1 mL, 常温下放置24 h, 用6 mol/L HCl溶液调pH值至中性, 用流动相稀释至10 mL, 摇匀, 作为碱破坏样品溶液。精密量取供试品储备液(C厂, 批号:11C8)5 mL, 加入6 mol/L HCl溶液1 mL, 常温下放置24 h, 用6 mol/L NaOH溶液调pH值至中性, 用流动相稀释至10 mL, 摇匀, 作为酸破坏样品溶液。精密量取供试品储备液(C厂, 批号:11C8)5 mL, 在160 ℃恒温箱中加热近干, 用流动相稀释至10 mL, 摇匀, 作为高温破坏样品溶液。精密量取供试品储备液(C厂, 批号:11C8)5 mL, 加入质量分数为3%的双氧水5 mL, 放置24 h, 用流动相稀释至10 mL, 摇匀, 作为氧化破坏样品溶液。
色谱柱:Durashell C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m); 流动相:10 mmol/L 高氯酸铵(氨水调节pH 8.20)-甲醇(48 ∶ 52, v/v); 流速:0.80 mL/min; 检测波长:254 nm; 柱温:50 ℃; 进样量:10 μ L。
实验分别考察了反相色谱常用的有机相溶剂(甲醇和乙腈)与水的混合体系为流动相以及在流动相中分别添加0.5%冰醋酸、0.6%冰醋酸、60%高氯酸、0.01 mol/L 磷酸、0.10 mol/L 磷酸盐缓冲液等对18 α -Gly、18 β -Gly、有关物质A和有关物质B分离效果及其灵敏度的影响。结果表明, 在4种待测物混合对照品能够达到基线分离的前提下, 以甲醇-水-60%高氯酸(55 ∶ 45 ∶ 0.5, v/v/v, 氨水调pH值至8.00)为流动相, 分离效果最好，灵敏度最高，保留时间最短。该流动相虽解决了两异构体分离的问题, 但甲醇-水-60%高氯酸体系的pH值在1.7左右, 以氨水调pH至8.00的操作比较繁琐; 因此采用高氯酸铵代替高氯酸, 再用氨水调pH值至8.20, 色谱行为不变, 且操作简单、快捷。
18 α -Gly和18 β -Gly是一对差向异构体, 流动相的pH值显著影响该异构体的拆分, 同时分离18 α -Gly和18 β -Gly需在pH≥7的条件下进行。欧洲药典7.0版、英国药典2012版、中国国家药品标准WS1-XG-2002收载的甘草酸单铵盐药品标准方法中采用的流动相分别为冰醋酸-乙腈-水(6 ∶ 380 ∶ 614, v/v/v)(欧洲药典和英国药典)和0.01 mol/L 磷酸-乙腈(62 ∶ 38, v/v)(WS1-XG-2002), 均为酸性体系, 对18 α -Gly、18 β -Gly异构体没有分离选择性(见图1)。
实验考察了高氯酸铵浓度在5～100 mmol/L 范围内对各色谱峰的分离度、灵敏度以及保留时间的影响。结果表明, 当高氯酸铵的浓度从5 mmol/L 升高至10 mmol/L 时, 4种待测物的灵敏度均达到最大值, 但对分离度及各色谱峰保留时间的影响不明显; 继续增加高氯酸铵的浓度, 可以改善4种待测物的分离度, 但会导致灵敏度下降, 各色谱峰的保留时间延长。实验选择高氯酸铵浓度为10 mmol/L。
实验考察了流动相pH值(6.45～8.93)对各色谱峰的分离度、灵敏度以及保留时间的影响。结果表明, pH值从6.45升高至8.20, 4种待测物的灵敏度均增加, 各色谱峰的保留时间明显缩短; pH=8.20时, 18 α -Gly和18 β -Gly刚好达到基线分离; 继续增大pH值, 除有关物质A外, 其他3种待测物的灵敏度仍随之增加, 但对18 α -Gly、18 β -Gly异构体的分离选择性降低。兼顾分离度和灵敏度的要求, 实验选择pH值为8.20。
实验考察了流动相中甲醇加入比例(45% 、50% 、52% 、55% 、60% , v/v)对各色谱峰的分离度、灵敏度以及保留时间的影响。结果表明, 随着甲醇加入比例的增加, 各色谱峰的保留时间逐渐缩短、灵敏度逐渐增加；当甲醇的加入比例为52%时, 差向异构体18 α -Gly和18 β -Gly恰好达到基线分离；甲醇含量继续增大, 两差向异构体的分离度小于1.5, 不符合药典要求。实验选用甲醇加入比例为52%。
许多研究表明, 温度对手性化合物的保留因子、分离度和柱效有一定的影响[ 17 ]。实验考察了柱温(25、30、40、45、50 ℃)对各色谱峰的分离度、灵敏度以及保留时间的影响。结果表明, 随着柱温的升高, 4种待测物的灵敏度增加, 各色谱峰的保留时间缩短, 分离度降低, 但不影响基线分离。当柱温大于50 ℃时, 会降低色谱柱使用寿命。在不影响分离且不损坏色谱柱的基础上, 实验选择柱温为50 ℃。
实验考察了流速(1.20、1.00、0.80、0.60、0.40 mL/min)对各色谱峰的分离度、灵敏度以及保留时间的影响。结果表明, 随着流速的降低, 理论塔板高度降低, 理论塔板数增加, 4种待测物的灵敏度和分离度均有一定程度的提高, 但各色谱峰的保留时间显著延长; 当流速为0.80 mL/min 时, 18 α -Gly和18 β -Gly达到基线分离; 流速继续降低, 各色谱峰的保留时间延长, 影响快速分离。综合分析, 实验选择0.80 mL/min 为最佳流速。
实验表明, 采用1.3节色谱条件时的分离效果最佳。
分别量取混合对照品溶液、供试品溶液、供试品加标溶液按1.3节色谱条件进样分析, 系统适用性试验测定结果见表1，色谱图见图2。
分别量取酸破坏、碱破坏、高温破坏、氧化破坏样品溶液, 按1.3节色谱条件进样分析。结果表明, 在酸、碱、高温、氧化等破坏条件下得到的降解产物在该色谱条件下均能与18 α -Gly、18 β -Gly、有关物质A和有关物质B色谱峰良好分离, 说明所建立的HPLC法具有良好的专属性。
精密量取18 α -Gly、18 β -Gly、有关物质A和有关物质B对照品储备液各1 mL, 分别置于10 mL容量瓶中, 用流动相稀释至刻度, 摇匀, 制成质量浓度各为100 mg/L 的对照品溶液, 用流动相逐级稀释, 得到一系列质量浓度不同的溶液, 按照1.3节色谱条件进样分析, 记录色谱图。以峰面积Y对质量浓度X(mg/L)作图, 绘制标准曲线；按3倍信噪比(S/N=3)确定检出限。甘草酸单铵盐中主成分及有关物质的线性方程、线性范围及检出限见表2。
取混合对照品溶液, 按照1.3节色谱条件进样分析, 连续进样6次。结果表明, 各色谱峰的保留时间波动小于0.02 min(n=6), 峰面积的RSD为0.05% ～0.36%(n=6)。
取同一批次的甘草酸单铵盐原料药(C厂, 批号:11C8)的供试品溶液6份, 按照1.3节色谱条件进样分析。结果表明, 各色谱峰的保留时间波动小于0.02 min(n=6), 峰面积的RSD为0.06% ～0.57%(n=6)。
取甘草酸单铵盐原料药(C厂, 批号:11C8)的供试品溶液, 按照1.3节色谱条件, 分别放置0、6、12、24、48、72 h时进样分析, 各色谱峰峰面积的RSD范围为0.39% ～1.06%(n=6), 表明制备好的供试品溶液在3 d内检测稳定性良好。
精密量取甘草酸单铵盐原料药(C厂, 批号:11C8)供试品溶液, 按该供试品溶液中各待测物浓度的80% 、100% 、120%分别加入18 α -Gly、18 β -Gly、有关物质A和有关物质B的对照品, 按照1.3节色谱条件进样分析, 记录色谱图。甘草酸单铵盐中主成分及有关物质的加标回收率见表3。
取对照品溶液, 按照1.3节色谱条件进样分析, 调节检测灵敏度, 使主成分色谱峰的峰高约为满量程的25% 。 分别取不同厂家生产的甘草酸单铵盐供试品溶液, 按照1.3节色谱条件进样分析, 记录色谱图至供试品溶液中主峰18 β -Gly保留时间的3倍, 分别计算4种待测物的含量, 结果见表4，甘草酸单铵盐对照品的色谱图见图3。
本工作在参考国内外相关文献和各国药典的基础上, 建立了同时测定甘草酸单铵盐原料药主成分及有关物质含量的RP-HPLC法。与欧洲药典7.0版、英国药典2012版和中国国家药品标准WS1-XG-2002收载的甘草酸单铵盐质量标准方法相比, 实现了对甘草酸单铵盐原料药主成分异构体18 α -Gly和18 β -Gly的有效分离, 使其主成分以及有关物质A和有关物质B在单一流动相、单流速、等度洗脱条件下取得良好的分离。该方法分离时间短, 检出限低, 分离度好, 线性范围宽, 结果准确、可靠, 可作为甘草酸单铵盐的检测方法, 用于甘草酸单铵盐原料药主成分、有关物质含量的检测与分析, 从而用于其原料药和制剂的质量控制, 对甘草酸单铵盐质量标准的修订具有一定的参考价值。
2013, Vol. 31 Issue (9): 869-874
PDF (830KB)
2013, Vol. 31 Issue (9): 869-874
PDF (830KB)