硝碘酚腈(nitroxynil)、氯羟柳胺(oxyclozanide)、氯氰碘柳胺(closantel)、碘醚柳胺(rafoxanide)是苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药,作用机理是通过阻断肝片吸虫的氧化磷酸化过程使虫体麻痹、死亡,从而达到杀虫的目的,用于驱杀牛、羊的肝片吸虫、蛔虫和绦虫感染,对血毛线虫、巨片吸虫和羊蝇蛆亦有较好作用。随着国内驱虫药的广泛应用和研究,发现高剂量硝碘酚腈可引起心脏、神经、肌肉和呼吸的损害[ 1 ];碘醚柳胺有明显的胚胎毒性[ 2 ];氯氰碘柳胺对肝、肾具有一定的毒副作用[ 3 ]。
为了避免消费者受到药物残留的危害，欧盟于2012年公布了最新的关于硝碘酚腈和氯氰碘柳胺在牛奶、羊奶中的最高残留限量(MRL)。分别如下：硝碘酚腈，牛(羊)奶20 μ g/kg；氯氰碘柳胺,牛(羊)奶45 μ g/kg；氯羟柳胺(牛奶)10 μ g/kg；还尚未公布碘醚柳胺在奶中的MRL。我国农业部235号公告[ 4 ]仅规定了牛、羊组织中硝碘酚腈、氯氰碘柳胺和碘醚柳胺的MRL，国内尚无关于这4种药物在奶中的MRL规定。
目前,国内外关于水杨酸苯胺类药物在组织中的残留检测方法主要有高效液相色谱(据4种药物的理化性质并参照国外文献报[ 5, 6, 7, 8, 9 ]、荧光检测器和质谱检测器[ 10, 11, 12, 13 ]联用以及高效液相色谱-串联质谱法[ 14, 15, 16, 17, 18, 19 ]。国内仅报道了高效液相色谱-串联质谱法[ 12 ]用于牛组织和牛奶中氯氰碘柳胺残留检测的研究,尚无关于水杨酸苯胺类药物在奶中的多残留检测方法报道。本研究采用HPLC分析奶中水杨酸苯胺类药物的多残留,并进行了方法学评价。
Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司); Centrifuge 5804台式高速离心机(美国Eppendorf公司); D10-24型氮气浓缩仪(杭州奥盛仪器有限公司); Milli-Q纯水机(美国Millipore公司); CNWBOND MAX固相萃取小柱(60 mg/3 mL,德国CNW科技公司)。
硝碘酚腈(纯度98.5% ,批号091205)、氯羟柳胺(纯度98.5% ,批号1670811)、氯氰碘柳胺钠(纯度94.1% ,批号67111001)和碘醚柳胺(纯度99.5% ,批号0505028)精制对照品均来自河北远征药业有限公司。
乙腈、甲醇(色谱纯,德国CNW科技公司)，乙酸铵(色谱纯,美国TEDIA公司)，氨水(分析纯,江苏强盛功能化学股份有限公司)。
标准储备液:准确称取适量的硝碘酚腈、氯羟柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺对照品,用乙腈分别配制成1 g/L 的单一标准储备液,密封,于4 ℃保存。1%三乙胺乙腈溶液:取1.0 mL三乙胺,用乙腈定容至100 mL,混匀。0.02 mol/L 乙酸铵溶液:准确称取 0.7708 g乙酸铵,加水定容至500 mL,用冰醋酸调pH至4.0。流动相:乙腈-0.02 mol/L 乙酸铵溶液(85 ∶ 15, v/v)。25%氨化乙腈溶液:取25.0 mL氨水,用乙腈定容至100 mL,混匀。5%甲酸-乙腈溶液:取5.0 mL甲酸,用乙腈定容至100 mL,混匀。混合标准中间工作液:准确量取标准储备液适量,用流动相稀释成含硝碘酚腈、氯羟柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺分别为2、1、4.5、1 mg/L 的混合标准中间工作液,密封,于4 ℃保存。
Phenomenex Gemini C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m)。流动相:乙腈(A), 0.02 mol/L 乙酸铵溶液(B)。梯度洗脱程序:0～4 min, 40%A～80%A; 4～12 min, 80%A; 12～14 min, 80%A～40%A; 14～20 min, 40%A。流速:1 mL/min;检测波长:290 nm;柱温:30 ℃;进样量:50 μ L。
准确称取5 g羊奶或牛奶置于50 mL离心管中,加入1 g的无水硫酸钠,再加入10 mL 1%三乙胺乙腈溶液,旋涡混匀1 min,置于振荡器上以300 r/min 振荡10 min,在4 ℃下以 8000 r/min 离心10 min。上清液转移至另一50 mL离心管中待净化。
MAX固相萃取柱预先用3 mL 25%氨化乙腈溶液活化,再将前述上清液装载入柱,以约1 mL/min 的流速过柱。待上清液流出后,依次用3 mL甲醇和3 mL水分别淋洗,负压抽干后用3 mL 5%甲酸-乙腈溶液洗脱,收集洗脱液,在40 ℃下氮气吹干,残渣用1.0 mL流动相溶解,转移至2 mL离心管中,加入用乙腈饱和的正己烷0.5 mL除脂,于4 ℃下15 000 r/min 离心10 min,上清液过0.22 μ m滤膜,供HPLC测定。
根据4种药物的理化性质并参照国外文献报道的方法[ 5, 10, 12, 14, 18, 19],对药物提取方法进行了考察。分别采用甲醇、乙醇、1%三乙胺乙腈、1%醋酸丙酮、乙酸乙酯、乙腈/丙酮混合液等为提取剂作对比试验。结果发现,加入乙酸乙酯后奶样品发生乳化现象。加入1%三乙胺乙腈溶液、1%醋酸丙酮溶液和乙腈/丙酮混合液的提取回收率相对较高,均在90%以上,且用1%三乙胺乙腈溶液提取得到的回收率较为稳定,可以直接过MAX小柱,故以1%三乙胺乙腈溶液作为提取溶剂。同时,在提取过程中加入一定量的无水硫酸钠来盐析蛋白,也能起到提高萃取率的作用。对比加入1、2、3、4、5 g的无水硫酸钠对回收率的影响,发现加入1 g时提取效果最好,回收率均在90%以上；随着加入量的增加,乙腈和无水硫酸钠发生结晶造成氯氰碘柳胺的回收率降低至72%左右,碘醚柳胺的回收率降低至55%左右。在除脂净化过程中,选择样品吹干复溶后除脂,用乙腈饱和的正己烷可以避免分析药物在除脂过程中损失,并可以降低环境污染。4种药物均属于弱酸性物质,MAX小柱属于强阴离子交换柱,适用于弱酸性药物的分离,因此提取液通过MAX柱后,药物得到很好的保留,洗脱后药物分离较好,没有杂质干扰。
通过紫外分光光度计扫描4种药物的最大吸收波长,其中硝碘酚腈为260 nm,氯羟柳胺为300 nm,氯氰碘柳胺、碘醚柳胺均为285 nm,然后通过紫外检测器分别观察了这4种药物在285、290、295、300 nm等波长处的响应情况。通过对比发现,在290 nm处4种药物的紫外吸收响应相对较好,基质干扰少,可以满足残留检测的要求。
比较了Gemini C18(250 mm×4.6 mm, 5 μ m)和CNW C18(250 mm×4.6 mm, 5 μ m)两种色谱柱对这4种药物的分离效果,发现硝碘酚腈和氯羟柳胺均有良好的保留；但在CNW C18色谱柱上,由于氯氰碘柳胺和碘醚柳胺极性较弱,当加大乙腈的比例后,发现这两种药的分离效果没有在Gemini C18柱上时好,而且梯度选择的时候纯标准溶液的基线在后两种药物出峰之前容易漂移,因此采用Gemini C18色谱柱。
文献[ 9 ]指出:氯氰碘柳胺在甲醇溶液中以原形和负离子形式存在,色谱图中表现为两个吸收峰;当pH值逐渐减小时,其负离子的吸收峰会逐渐减小,因此采用酸性条件下的流动相有利于氯氰碘柳胺的检测。对比了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.01 mol/L KH2PO4 (pH 3.5)、甲醇-0.01 mol/L 乙酸铵、乙腈-0.02 mol/L 乙酸铵4种流动相。发现乙腈-0.02 mol/L 乙酸铵对于4种药物的分离效果最好。通过检测,发现硝碘酚腈在流动相为乙腈-0.02 mol/L 乙酸铵(60 ∶ 40，v/v)的条件下出峰时间约在5.1 min;其余3种药物出峰较晚,氯氰碘柳胺和碘醚柳胺约在25～30 min。随着有机相比例的增大,硝碘酚腈的出峰时间约在3.5～4.0 min,容易受溶剂峰的干扰。为调整药物出峰时间以获得更好的峰形,并尽量减少杂质峰干扰,本试验采用梯度洗脱方法。最后对比了0.02 mol/L 乙酸铵在pH 2.5、3.5、4.0、6.0时药物的出峰时间、峰形、灵敏度与噪声的影响,发现在pH 4.0条件下,4种药物的出峰时间和峰形相对较好，药物的灵敏度较高，基线平稳。
称取空白奶适量,添加不同质量浓度的混合标准工作液,使其含量分别为5、10、20、50、100、200、500 μ g/kg,按1.4节进行处理,每一含量水平平行测定4次,以药物含量(X, μ g/kg)与相应的色谱峰面积(Y)作线性回归,求得标准曲线回归方程和相关系数见表1。
称取(5.00±0.05) g空白羊奶或牛奶,分别加入适量的4种药物的混合标准工作液,制得含4种药物分别为1、2、3、4、5、10 μ g/kg 的样品,每个含量水平做3个平行样品。按照1.4节方法处理后,以信噪比(S/N)≥3时的最低含量为检出限,S/N ≥10时的最低含量为定量限。测得空白牛奶和羊奶中4种药物的检出限均为3 μ g/kg,定量限均为5 μ g/kg。
结果表明4种药物在5～500 μ g/kg 范围内线性关系良好,相关系数均不低于0.99;检出限和定量限均低于我国和欧盟的MRL值,满足残留检测的要求。
采用在空白样品中加标的方法进行准确度和精密度的测定。根据欧盟对硝碘酚腈、氯羟柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺制定的最高残留限量及残留控制要求,加入不同质量浓度的混合标准工作液,制得含有4种水杨酸苯胺类药物分别为硝碘酚腈(10、20、40 μ g/kg)、氯羟柳胺(5、10、20 μ g/kg)、氯氰碘柳胺(22.5、45、90 μ g/kg)、碘醚柳胺(5、10、20 μ g/kg)的空白加标样品。按照1.4节方法处理样品,每个含量水平做5个平行样品,共做4个批次,不同批次间隔一天或者数天,分别记录4种药物的色谱峰面积。混合标准溶液的色谱图见图1,空白加标样品的色谱图见图2和图3(4种药物的添加含量分别是:硝碘酚腈20 μ g/kg、氯羟柳胺10 μ g/kg、氯氰碘柳胺45 μ g/kg 和碘醚柳胺10 μ g/kg)。回收率和精密度结果见表2。结果表明,该法可满足兽药残留检测方法的技术要求。
本实验建立了HPLC测定奶中硝碘酚腈、氯羟柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺的多残留检测方法。结果表明,该方法简单易行,利于推广;检出限和定量限低于目前国际上颁布的最高残留限量值。在各添加水平下的平均回收率、回收率的相对标准偏差均符合农业部农发[2003]1号《关于发布＜兽药残留实验技术规范(试行)＞的通知》的规定要求,适用于牛奶和羊奶中水杨酸苯胺类药物多残留的定量检测。
2013, Vol. 31 Issue (10): 1028-1032
PDF (798KB)
2013, Vol. 31 Issue (10): 1028-1032
PDF (798KB)