Agilent毛细管电泳仪,Agilent 1260液相色谱仪(Waldbron,德国), LCQ Fleet离子阱质谱仪(Thermo Scientific,美国), Millipore-Simplicity UV超纯水系统(Millipore, MA,美国)。熔融石英毛细管(SGE Analytical Science,澳大利亚), 50 μ m i.d., 370 μ m o.d.,柱长34.5 cm,有效长度26 cm。

乙酰胆碱酯酶、盐酸硫代乙酰胆碱(AThCh)购自Sigma-Aldrich,小檗碱(berberine)、药根碱(jatrorrhizine)、黄连碱(coptisine)、巴马汀(palmatine)购自阿拉丁,木兰花碱(magnoflorine)、表小檗碱(epiberberine)、非洲防己碱(columbamine)、甲基黄连碱(worenine)购自上海彩佑实业有限公司,异丙醇、四硼酸钠和 β -环糊精均为AR级,购自国药集团化学试剂有限公司,乙腈(HPLC级)购自Merck,甲酸(HPLC级)购自TEDIA,黄连饮片购自上海雷允上药店。

黄连粗提物的制备:取10 g黄连饮片,磨成细粉,加入50 mL 70% (v/v)乙醇超声提取3次,每次45 min,所得提取液经抽滤后用旋转蒸发仪浓缩,然后抽真空干燥待用。用于分离纯化的黄连粗提物溶液的配制:称取黄连粗提物30 mg,加入3 mL含50% (v/v)异丙醇的水溶液配制成为10 g/L 的溶液,涡旋混合,超声溶解2 min,以 12000 r/min 离心3 min。用于活性测试的溶液的配制:黄连粗提物、各种标准品、半制备色谱柱纯化的组分用50%(v/v)异丙醇水溶液溶解并用水配成质量浓度为0.25 g/L 的溶液。

其他溶液由Millipore纯化系统净化的超纯水配制,所有缓冲溶液使用前需用0.45 μ m滤膜过滤。所有溶液使用时均需新鲜配制。

分析色谱柱为Agilent XDB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μ m);流动相A相为10 mmol/L 甲酸铵(含0.1%(v/v,下同)甲酸)水溶液,B相为乙腈(含0.1%甲酸)。采用30 min梯度洗脱：0～6 min, 5%B～20%B;6～25 min, 20%B～30%B; 25～30 min, 30%B～100%B;流速为1 mL/min。黄连粗提物的质量浓度为1 g/L;检测波长为345 nm,进样体积为10 μ L。

电喷雾电离正离子模式,喷雾电压为4.5 kV,鞘气流速12 L/min,辅助气流速1.5 L/min,金属毛细管温度为320 ℃,金属毛细管电压为35 V,二级质谱碰撞能量为36 V。

半制备色谱柱为Thermo Scientific ODS-C18(250 mm×10 mm, 5 μ m);流动相A相为H₂O (含0.1%甲酸), B相为乙腈 (含0.1%甲酸)。采用20 min梯度洗脱:0～20 min, 25%B～ 32%B;流速为3.5 mL/min。黄连粗提物的质量浓度为10 g/L;检测波长为345 nm,进样体积为50 μ L。

新毛细管柱用0.1 mol/L NaOH溶液处理30 min,再分别用去离子水、30 mmol/L 硼砂缓冲溶液冲洗5 min。每次上样分析前用1 mol/L NaCl、0.1 mol/L NaOH、去离子水、缓冲液冲洗3 min。本文中乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选的实验步骤如图1所示:(1)将0.4 g/L ACHE和底物AThCh(含或不含抑制剂)溶液分别以 2000 Pa×4 s的压力依次导入毛细管进样端。在每次进样前设定进样程序,使毛细管柱进口端浸入盛有去离子水的样品瓶中5 s以防止样品之间的污染。(2)在毛细管两端加上1 kV×15 s的电压使酶溶液和底物溶液区带充分混合。(3)在毛细管两端加上15 kV的电压将未反应底物和产物在线分离,通过紫外检测可直接测定产物巯基胆碱(TCh)的面积,即可以表征酶的活性。对于抑制剂的筛选,在底物溶液中加入一定量的待筛选化合物,通过产物TCh峰面积的减小来判定待筛选化合物是否具有抑制酶活性的作用。

图1

Fig. 1

图 1 (a)电泳介导的酶微反应器(EMMA)测试ACHE活性的 示意图和(b)ACHE催化水解AThCh的反应方程式 Fig. 1 (a) Schematic illustration of EMMA procedure for ACHE activity assay and (b) ACHE catalyzed reaction

经过优化后的电泳条件为:毛细管总长为34.5 cm,有效长度为26 cm,柱内径为50 μ m;缓冲溶液为30 mmol/L 硼砂(pH=8.00),含15 mmol/L β -环糊精;进样 2000 Pa×4 s;分离电压为15 kV;柱温37 ℃;检测波长230 nm;酶质量浓度0.4 g/L;硫代乙酰胆碱浓度为10 mmol/L(含20 mmol/L 硫酸镁);混合时间15 s;孵育时间0 min。

本文采用HPLC-MS对黄连粗提物溶液(1 g/L)进行分析,通过改变流动相中甲酸的含量,缓冲盐的类型(乙酸铵、甲酸铵)及其浓度,最终确定用于HPLC分析的最佳流动相组成为10 mmol/L 甲酸铵水溶液-乙腈(各含0.1%甲酸)。UV检测器检测波长为345 nm,质谱检测采用正离子模式。所得到的色谱图和总离子流图见图2。黄连粗提物中的主要成分是异喹啉生物碱。我们得到的黄连粗提物的HPLC-MS/MS色谱图有13个峰,其中8个主要峰经质谱鉴定,分别是木兰花碱(峰3)、药根碱(峰6)、表小檗碱(峰7)、非洲防己碱(峰8)、黄连碱(峰9)、甲基黄连碱(峰10)、巴马汀(峰11)、小檗碱(峰12),它们的结构式如图3。

图2

Fig. 2

图 2 黄连粗提物的HPLC分析 Fig. 2 HPLC analysis of Rhizoma coptidisextract a. UV chromatogram; b. total ion chromatogram. Primary peaks: 3. magnoflorine; 6. jatrorrhizine; 7. epiberberine; 8. columbamine; 9. coptisine; 10. worenine; 11. palmatine; 12. berberine.

图3

Fig. 3

图 3 黄连粗提物中部分生物碱的结构式及对ACHE的IC50值 Fig. 3 Structures of some alkaloids of Rhizoma coptidis extract and IC50 values for ACHE inhibition

由于使用半制备HPLC对黄连粗提物进行分析时,进样量增加,因此除了图2中经质谱鉴定的8个峰之外(其中7和8号峰重叠在一起,视为一个组分),其他5个峰的紫外响应信号得到增强,其色谱分离如图4a所示。

图4

Fig. 4

图 4 黄连粗提物的(a)半制备色谱分离图及(b)分离制备的13个组分对ACHE的抑制率 Fig. 4 (a) Chromatogram of semipreparative HPLC analysis of Rhizoma coptidis extract and (b) inhibition rates of thirteen fractions of Rhizoma coptidis extract on ACHE

采用本课题组发展的乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法^{[ 18 ]}对黄连粗提物及HPLC分离制备的化合物进行活性测试,其电泳分离图如图5所示,从图5中可明显看出底物AThCh、抑制剂和产物TCh都达到了基线分离,并且当筛选样品底物溶液中加有黄连粗提物时,其产物峰面积与空白相比明显降低。将分离纯化的每个组分用真空离心干燥仪干燥后,用50% (v/v)异丙醇水溶液重新溶解,用EMMA分别测定各组分对ACHE的抑制作用,各个组分的抑制作用百分比如图4b所示。结果表明,在各组分质量浓度为0.25 g/L 下,除了组分1、2、3对ACHE的活性没有抑制作用外,其余的9个组分均有不同程度的抑制作用,其抑制作用由强到弱排序为:组分12＞11＞7+8＞6＞10≈ 9 ≈ 5＞13＞4。

图5

Fig. 5

图 5 ACHE抑制剂筛选的电泳分离图 Fig. 5 Electropherograms for screening the ACHE inhibitor a. without Rhizoma coptidis extract; b. presence of the inhibitor Rhizoma coptidis extract.

2.2 活性化合物组分的验证

我们用8个化合物的标准品进行活性测试验证,发现除了木兰花碱没有抑制作用以外,其余的7种化合物均有抑制作用,这个结果与黄连粗提物分离制备的组分的抑制作用相吻合。我们测得的这7种化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制曲线如图6所示,测得这7种化合物的IC₅₀值见图3。

图6

Fig. 6

图 6 黄连粗提物中7种生物碱对ACHE的抑制曲线 Fig. 6 Inhibition curves of ACHE in the presence of seven alkaloids

结果显示,木兰花碱这种非小檗碱型生物碱对ACHE没有抑制作用。7种小檗碱型生物碱的2、3、9、10、13位有着不同的取代基(见图3),其取代基可能为-OH、-OCH₃、-OCH₂O-、-CH₃。通过对比各化合物的IC₅₀值可知,不同的取代基将会影响化合物的抑制活性。

比较小檗碱和巴马汀以及表小檗碱和黄连碱,前者的抑制作用为后者的3倍多以及2倍多,之所以抑制作用有如此大的差异,主要是因为R²、R³不同,表明R²、R³处的-OCH₂O-对抑制作用有着增强的作用。当巴马汀的R³或R²取代基的-OCH₃变为-OH时,化合物相应变为药根碱、非洲防己碱,其抑制作用有所增强,表明了R²、R³处的-OH对ACHE的抑制作用也有增强的作用。R⁹、R¹⁰对ACHE的抑制作用同样具有重大的影响。当巴马汀的R⁹、R¹⁰处的-OCH₃变为-OCH₂O-,其对ACHE的抑制作用降低至不足原来的1/8;当小檗碱的R⁹、R¹⁰处的-OCH₃变为-OCH₂O-,其对ACHE的抑制作用降低至不足原来的1/11,这一结果表明R⁹、R¹⁰处的-OCH₃对ACHE的抑制作用有着增强作用。R¹³同样影响对ACHE的抑制作用,当黄连碱的R¹³变为-CH₃,其抑制作用降低至不足原来的1/2,这一结果表明R¹³处的-CH₃对ACHE的抑制作用有减弱效果。总之,所得到的结果表明了木兰花碱、表小檗碱、黄连碱、甲基黄连碱没有或者具有较弱的抑制作用,而药根碱、非洲防己碱、巴马汀、小檗碱具有较强的抑制作用。

本文建立了CE的活性测试与HPLC-MS的快速分离相结合的技术用于筛选天然产物活性成分,可以实现天然产物活性成分的分离纯化、活性测试和结构鉴定。HPLC-MS具有较高的分离效能,每次分离制备仅需20 min; CE可以较快地进行活性测试,每次分离仅需2.5 min。纳升级的酶用量使筛选成本显著降低,纳升级的待筛化合物用量减轻了对天然产物分离制备的工作量。将分离纯化-活性筛选相结合,可以适用于复杂样品,可以高效、有选择性地对天然产物进行活性成分的筛选和结构鉴定。本工作建立的CE/HPLC-MS筛选体系为高通量快速筛选、寻找先导化合物以及开发新药提供了新技术。