Agilent 1260高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器); 乙腈、甲酸(色谱纯, Merck公司); 试验用水为Milli-Q超纯水。标准物质:双氰胺(纯度99.4% , Sigma-Aldrich公司)。

双氰胺标准溶液的配制:准确称取100 mg双氰胺标准品于100 mL容量瓶中, 用水溶解, 配制成1.0 g/L 的储备液。用流动相将标准储备液稀释成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L 的系列标准溶液。

液相色谱柱:XBridge Amide柱(250 mm×4.6 mm, 3.5 μ m, Waters公司); 柱温:35 ℃; 进样量:20 μ L; 流动相:乙腈-水(体积比为90 ∶ 10)(含体积分数为0.2%的甲酸); 流速:1.0 mL/min; 检测波长:218 nm。

称取固态、半固态样品(奶粉、炼乳等)1 g(精确到0.01 g)或液态样品(纯奶、酸奶等)2 g(精确到0.01 g), 置于10.0 mL比色管中, 固态、半固态样品加入3 mL 70 ℃热水, 液态样品加入1 mL 70 ℃热水充分涡旋2 min, 置于70 ℃热水浴中15 min充分溶解提取, 冷却至室温, 涡旋中分3次加入乙腈, 每次加入2 mL, 最后用乙腈定容至10.0 mL, 涡旋摇匀, 取2 mL液体至2 mL离心管中, 以 8000 r/min 离心10 min, 取1.0 mL上清液于50 ℃下氮气吹干, 用1.0 mL流动相溶解, 过0.45 μ m滤膜, 滤液供HPLC分析。

对双氰胺标准溶液进行光谱扫描, 发现在218 nm处有最大吸收, 确定其检测波长为218 nm。

双氰胺在C18柱上几乎无保留。双氰胺的性质和三聚氰胺类似, 因此试图采用与三聚氰胺检测相同的多种离子对试剂如庚烷磺酸钠等作为流动相^{[ 13, 14 ]}, 但是没有达到预期效果。基于双氰胺的性质, 采用了XBridge Amide柱作为分离柱。选择不同比例的乙腈-水作为流动相, 对双氰胺标准溶液进行测定, 没有出现目标物色谱峰, 加入少量甲酸后, 得到相应的目标物色谱峰。通过实验最终确定以含0.2%甲酸的乙腈-水(90/10，v/v)作为流动相时, 目标峰的峰形和保留时间最佳, 并且目标峰的保留时间为5 min左右, 大大减少了基质对目标峰的干扰作用, 优化条件下的标准溶液色谱图见图1。

图1

Fig. 1

图1 双氰胺的高效液相色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of dicyandiamide a. standard; b. spiked milk sample.

乳制品基质比较复杂, 对检测的主要干扰物为脂肪和蛋白质, 因此除去脂肪和蛋白质的干扰最为关键。综合考虑采用有机试剂沉淀蛋白质, 便于后续样品的处理。

直接用乙腈进行定容后涡旋超声提取, 发现回收效果不稳定, 回收率差异较大, 且乳制品中的蛋白质往往黏结成块状。推测在乙腈快速加入后, 蛋白质迅速黏结包夹了部分双氰胺。考察了缓慢加入乙腈对蛋白质沉淀和回收率的影响。结果表明，在涡旋条件下, 缓慢加入乙腈能有效地防止蛋白质迅速黏结, 蛋白质呈分散状态, 回收率高且稳定。另外还考察了超声提取对回收率的影响, 结果表明, 在涡旋过程中缓慢加入乙腈后超声与否不影响提取效果。故本文采用在涡旋过程中缓慢加入乙腈的提取方式。

实验发现将上述提取液过微孔滤膜后直接进样, 样品色谱图会有很高的溶剂峰。取1.0 mL提取液于50 ℃下氮气吹干, 再用1.0 mL流动相溶解, 过滤膜, 滤液供HPLC分析, 则样品色谱图中的溶剂峰消失, 因此, 样品提取后取1.0 mL提取液用氮气吹干, 再用流动相重新溶解样品, 供色谱检测。

对双氰胺的标准溶液进行检测, 以仪器响应的峰面积Y对双氰胺的质量浓度X进行线性回归, 双氰胺在0.5～50 mg/L 范围内的线性关系良好, 回归方程为Y=153.87X+21.56, 相关系数(r²)为 0.9999。在空白样品处理液中添加双氰胺标准品, 以S/N=3确定方法的检出限, 以S/N=10确定方法的定量限, 得到双氰胺的检出限为0.2 mg/kg, 定量限为0.5 mg/kg。

对乳粉(经确认不含双氰胺)样品进行回收率试验, 添加水平分别为1.0、2.0和5.0 mg/kg, 采用优化后的前处理方法对样品进行处理, 每个添加水平重复6次, 平均回收率分别为101.0% 、96.7%和99.7% , RSD分别为4.8% 、4.5%和4.9%(见表1)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 乳制品中双氰胺的加标回收率(n=6) Table 1 Recovery of dicyandiamide spiked in dairy products (n=6) Spiked/(mg/kg) Found/(mg/kg) Recovery/% RSD/% 1.0 1.010 101.0 4.8 2.0 1.994 99.7 4.5 5.0 4.835 96.7 4.9

表1 乳制品中双氰胺的加标回收率(n=6) Table 1 Recovery of dicyandiamide spiked in dairy products (n=6)

采用本方法对鲜奶、酸奶、炼乳、乳粉等40批乳制品进行检测, 结果均未检出双氰胺。