超高效液相色谱-串联质谱法同时测定粮食及肉制品中的24种工业染料


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冯月超, 贾丽 , 何亚荟, 王建凤, 刘艳, 范筱京

北京市理化分析测试中心, 北京市食品安全分析测试工程技术研究中心, 北京 100089

收稿日期：2013-03-07

基金项目：北京市科技专项项目(Z111106055311093).

通讯作者：贾丽.Email: jiali214@yahoo.com.cn.

摘要：建立了测定粮食及肉制品中24种禁用工业染料的超高效液相色谱-串联质谱法。样品经甲醇、乙腈提取后,过WAX固相萃取柱净化。采用ACQUITY UPLC BEH C18分析柱分离,以10 mmol/L乙酸铵-0.2%甲酸水溶液和甲醇-乙腈(7:3, v/v)为流动相梯度洗脱,多反应监测(MRM)模式测定。24种染料的相关系数R²均大于0.99,回收率在61%~116%之间,方法的精密度(RSD, n=6)小于13%,定量限在0.1~4.0 μg/kg。该方法灵敏度高,操作简单、高效,适合于粮食及肉制品中24种禁用工业染料的同时定量及确证分析。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱固相萃取工业染料粮食肉制品

Simultaneous determination of 24 industrial dyes in grain and meat products by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

FENG Yuechao, JIA Li , HE Yahui, WANG Jianfeng, LIU Yan, FAN Xiaojing

Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis, Beijing Engineering Research Center of Food Safety Analysis, Beijing 100089, China

Received: 2013-03-07

Abstract: An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) analytical method was established for the simultaneous determination of 24 forbidden industrial dyes in grain and meat products. The sample was extracted with methanol and acetonitrile, and cleaned-up by a WAX solid phase extraction column. The solution was separated on an ACQUITY UPLC BEH C18 column eluted with a mixture of 10 mmol/L ammonium acetate-0.2%formic acid aqueous solution and methanol-acetonitrile (7:3, v/v) as the mobile phases, and then analyzed in multiple reaction monitoring (MRM) mode. The correlation coefficients were above 0.99, the average recoveries were 61%-116%, and the relative standard deviations (RSD, n=6) were lower than 13%. The quantification limits were 0.1-4.0 μg/kg. This method is simple, effective, sensitive, and suitable for the determination and confirmation of the 24 forbidden industrial dyes in grain and meat products.

Key words: ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) solid phase extraction (SPE) industrial dyes grain meat products

近年来,工业染料在食品中非法添加的事件在国内外频繁发生,如苏丹红事件、麻辣鱼调料、花椒中加入工业染料罗丹明B等。这是由于工业染料价格低廉、着色强、稳定性高、带来高利润的同时还容易逃避监督、监管。但这些工业染料大部分含有芳香结构,可在人体内代谢分解产生芳香胺类物质,而大多数芳香胺类物质具有高毒性、高残留和“三致”(致畸、致癌、致突变)等副作用。为了加强对该类物质的监管,国家严令禁止将这类物质添加到食品中。为了保障人们的食品安全,建立食品中多种工业染料同时测定的方法迫在眉睫。

目前检测食品中非法添加工业染料的方法很多,包括免疫法^{[ 1 ]}、毛细管电泳法^{[ 2 ]}、电化学分析法^{[ 3 ]}、薄层色谱法^{[ 4 ]}、高效液相色谱法^{[ 5, 6, 7, 8, 9 ]}、气相色谱-质谱联用法^{[ 10 ]}和液相色谱-质谱联用法^{[ 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ]}。免疫法容易出现假阳性或者假阴性的问题;毛细管电泳法、电化学分析法和薄层色谱法都存在灵敏度、选择性和分析通量不足的问题;气相色谱法不适用于分析高沸点、难挥发的染料。液相色谱法适用范围广泛,对样品前处理的要求不高,是测定染料较为常用的方法,但这种方法存在定性差的缺点;超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)克服了以上方法的缺点,具有检测时间短、分离度高、定性定量准确的特点。针对禁用工业染料种类繁多,添加种类难以预测的特点,研究食品中多种禁用染料的同时测定方法非常有必要。赵珊等^{[ 11 ]}检测了果汁和葡萄酒中的27种工业染料,该方法采用液-液萃取的前处理方式,只适用于果汁和葡萄酒等液体样品;冯峰等^{[ 12 ]}采用HLB固相萃取前处理的方式筛查了葡萄酒中的14种禁用食品添加剂;伊雄海等^{[ 13 ]}采用聚酰胺柱分析了硬糖、果酱、液态奶、果汁中的12种水溶性易滥用着色剂;曹鹏等^{[ 14 ]}采用WAX柱进行前处理,但只分析了食品中的6种工业染料。由于肉制品和粮食制品在人们的日常生活中消耗量大,一旦被非法添加工业染料将会产生重大的影响,因此本文以这两种食品为研究对象,建立了采用WAX固相萃取前处理技术、超高效液相色谱-串联质谱同时测定食品中24种禁用染料的方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

超高效液相色谱仪-四极杆串联质谱仪:Waters公司,型号ACQUITY UPLC、Xevo TQ-S;高速冷冻离心机:Sigma公司,型号4K15;恒温水浴氮吹仪:Organomation公司,包括N-EVAPTM 111氮吹仪和OA-SYSTM水浴加热装置;数控超声波清洗器: 昆山市超声仪器有限公司,型号KQ-500DE;超纯水仪:Millipore公司,型号Elix10;固相萃取柱(Waters公司,型号Oasis WAX, 3 mL/60 mg, 30 μ m)。

1.1.2 标准品及配制方法

所有标准品均购自Dr. Ehrenstorfer GmbH,纯度均大于70% 。

对位红:先用丙酮溶解,再用乙腈定容配制成200 mg/L(按纯度标示折算)的单标准储备液。孔雀石绿、结晶紫、苏丹橙G、苏丹红G、苏丹蓝2、苏丹红Ⅰ:用乙腈配制质量浓度为200 mg/L(按纯度标示折算)的单标准储备液。其余标准品:均用甲醇配制质量浓度为200 mg/L(按纯度标示折算)的单标准储备液。

1.2 样品前处理方法

1.2.1 提取

称取粉碎并混合均匀的粮食制品或肉制品样品2.5 g于离心管中,加入2 g无水硫酸钠,再加入5 mL甲醇于超声振荡器上超声10 min,于 8000 r/min 下离心3 min,上清液倾入25 mL容量瓶中,残渣中再加入5 mL甲醇提取一次,合并上清液;残渣再用乙腈提取两次(5 mL×2),合并上清液，用超纯水定容于25 mL待测。同时做试剂空白样。

1.2.2 净化

将WAX固相萃取柱依次用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL固相萃取平衡液(10 mmol/L乙酸铵-0.2%甲酸的水溶液)活化。移取样液用固相萃取平衡液按照1 ∶ 1的体积比稀释,混匀;取10 mL稀释液(相当于5 mL样液)过WAX小柱,依次用3 mL固相萃取平衡液、3 mL水清洗。先用2 mL甲醇洗脱,再用8 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱,洗脱液合并于10 mL试管中,在60 ℃下用氮气吹干；用1 mL甲醇-水(2 ∶ 1, v/v)溶解,过0.2 μ m滤膜,滤液待UPLC-MS/MS测定。

1.3 UPLC-MS/MS条件

1.3.1 UPLC条件

色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μ m);流动相:A相为甲醇-乙腈(7 ∶ 3, v/v), B相为10 mmol/L 乙酸铵-0.2%甲酸水溶液。梯度洗脱程序:0～1 min, 10%A～30%A; 1～3 min, 30%A～55%A; 3～7 min, 55%A～70%A; 7～10 min, 70%A～90%A。流速:0.3 mL/min;柱温:30 ℃;进样量:10 μ L。

1.3.2 质谱条件

离子源:电喷雾离子源(ESI);检测方式:多反应监测(MRM);毛细管电压:2.5 kV;离子源温度:150 ℃;脱溶剂温度:500 ℃;脱溶剂气流量:1000 L/h;锥孔气流量:50 L/h;碰撞气体:氩气。其他参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 UPLC条件的优化

本实验采用ACQUITY UPLC BEH C18分析柱分离,24种染料在分析柱上均获得了理想的分离效果,24种染料的出峰时间为2～11 min。流动相A液采用乙腈和甲醇的混合液,增加了洗脱能力；B液

表1 24种染料的质谱参数 Table 1 MS parameters for the 24 dyes

采用乙酸铵和甲酸溶液使正离子和负离子都能得到很好的电离。标准混合液和样品均采用甲醇-水(2 ∶ 1, v/v)稀释或复溶,能得到良好的峰形。24种染料标准溶液的MRM色谱图见图1。

图1 24种染料标准溶液的MRM色谱图 Fig.1 MRM chromatograms of the 24 dyes

2.2 质谱条件的优化

观察所测物质的结构,工业染料中很多物质是钠盐或者氯盐,对于含钠离子或者氯离子的物质,由于在含有水的流动相中钠离子和氯离子容易电离,因此在质谱中易形成[M-Cl]⁺、[M-Na]^-或者[(M-nNa+nH)+H]⁺的准分子离子峰。采用全扫描模式,大部分染料在ESI+方式下,可获得较高丰度的[M+H]⁺母离子,其中酸性蓝1、酸性绿9、酸性紫9、酸性紫43的母离子为[(M-nNa+nH)+H]⁺,本身为阳离子的罗丹明B、结晶紫、孔雀石绿的母离子为[M-Cl]⁺,在ESI-模式下,酸性黄36、酸性橙II的母离子为[M-nNa]^-,分散黄1的母离子为[M-H]^-。通过调节锥孔电压使各个物质的母离子峰最强。

在优化的锥孔电压下,采用子离子扫描模式,通过对碰撞能量的优化,得到各物质的最佳检测条件(见表1)。

2.3 前处理条件的优化

2.3.1 样品提取过程的优化

由于工业染料很容易吸附到样品上,很难被提取出来。对加标样品分别提取1次、提取2次、提取3次和提取4次的对比试验结果表明,用甲醇提取2次、乙腈再提取2次时的回收率较高。

2.3.2 样品溶液稀释倍数的优化

Oasis WAX固相萃取柱填充物是混合型弱阴离子交换反相吸附剂,对本实验中24种物质都有很好的吸附。由于提取液含有大约80%的有机相,因此会影响固相萃取柱的吸附效果。本实验考察了小米样液的稀释倍数对回收率的影响。取样液3 mL,分别加入平衡液0、3、6、10、20、30 mL,将稀释液全部上柱后测定回收率。结果表明,不加平衡液稀释时的回收率最低,其余加平衡液的5组试验结果没有显著性差异。综合考虑,采用加入等体积平衡液的方法对样液进行稀释。

2.3.3 洗脱方法的优化

实验发现只采用氨水-甲醇(5 ∶ 95, v/v)洗脱时除了6种酸性染料的回收率不受影响外,其余染料的回收率均会显著降低。经过分析发现这是由所测工业染料的酸碱性不同造成的,因此实验首先用3 mL甲醇洗脱中性和碱性化合物,再用6 mL氨水-甲醇(5 ∶ 95, v/v)洗脱强酸性和弱酸性化合物。

2.4 线性方程及检出限

配制系列浓度的24种染料的混合标准溶液,以染料的峰面积y对其质量浓度x( μ g/L)进行线性回归做标准曲线,得到的线性方程见表2。

将线性范围最低浓度点的标准溶液稀释，在S/N=3时对应的质量浓度换算成样品中的含量即为LOD，在S/N=10时即为LOQ。结果见表2。

表2 24种工业染料的线性范围、线性方程、相关系数(R²)、检出限(LOD)和定量限(LOQ) Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients, LOD and LOQ of the 24 industrial dyes

2.5 试剂空白

由于染料吸附性强,实验过程中容易污染色谱分析系统,因此必须同时做试剂空白。本研究发现,试剂空白中含有结晶紫和苏丹红G,在计算回收率时应减去空白值。

2.6 方法的回收率和重现性

选择不含工业染料的4种样品:小米、玉米粉、香肠、猪头肉,采用本文建立的方法分别测定样品的添加回收率,结果见表3,所测各染料的回收率范围为61% ～116% ,精密度范围为0.8% ～13% 。

表3 空白样品中24种工业染料的加标回收率和精密度(n=6) Table 3 Recoveries and RSDs for the 24 industrial dyes spiked in blank samples (n=6)

Name	Spiked/( μ g/kg)	Millet		Corn meal		Sausage		Ready cooked pork
Name	Spiked/( μ g/kg)	Recovery/%	RSD/%	Recovery/%	RSD/%	Recovery/%	RSD/%	Recovery/%	RSD/%
Acid Blue 1	400	95.2	2.4	81.5	11.2	90.0	1.9	77.7	8.4
	40	92.3	4.5	88.6	5.8	86.5	5.6	75.3	6.3
	4	88.4	7.3	74.6	10.2	72.3	4.2	68.5	5.0
Disperse Yellow 9	400	86.1	6.2	83.2	2.5	85.4	3.9	81.4	3.4
	40	85.0	4.8	82.6	3.6	82.5	8.2	70.1	6.9
	4	78.3	10.9	71.2	8.9	65.2	10.5	62.5	12.6
Rhodamine B	20	111.9	9.7	85.6	3.0	102.2	4.5	115.9	12.6
	2	90.5	7.0	98.7	7.2	112.5	5.6	118.3	9.5
	0.2	105.5	8.9	106.3	6.3	114.7	10.4	107.5	10.2
Disperse Brown 1	200	72.6	7.3	75.5	4.2	74.2	6.2	69.7	2.9
	20	67.0	6.2	69.4	4.5	71.8	9.3	61.5	4.0
	2	61.5	8.5	62.8	8.9	66.2	5.1	67.1	6.5
Disperse Blue 124	20	98.5	4.0	70.8	7.4	100.7	1.8	87.0	7.2
	2	80.4	2.8	72.8	1.4	94.8	5.4	79.4	6.5
	0.2	82.1	4.9	74.9	5.8	89.6	2.5	82.6	10.3
Crystal Violet	20	103.4	5.0	83.4	0.8	83.1	3.3	81.7	2.7
	2	92.0	2.4	84.7	7.2	86.9	2.5	66.8	2.2
	0.2	66.2	2.0	73.4	4.1	62.1	4.0	65.9	3.2
Disperse Blue 106	20	92.4	3.9	74.1	5.7	70.8	4.5	72.4	6.9
	2	81.2	4.2	65.8	2.4	62.5	2.1	72.1	7.8
	0.2	102.5	9.8	66.4	8.8	66.1	10.6	62.5	5.1
Disperse Red 1	20	79.9	3.6	72.7	3.9	84.8	2.7	74.7	8.6
	2	65.5	5.3	78.3	3.2	68.7	2.0	68.9	2.9
	0.2	75.2	4.1	102.6	11.6	70.2	7.2	68.7	3.9
Disperse Yellow 3	20	74.9	2.8	73.4	3.7	76.6	6.8	73.9	9.9
	2	83.6	3.9	68.9	4.8	73.6	5.1	85.0	8.8
	0.2	72.0	5.0	61.0	2.2	88.9	12.1	69.7	7.1
Sudan Orange G	200	77.0	5.7	85.4	6.1	86.3	4.1	79.4	3.2
	20	81.6	4.0	89.7	4.6	92.5	4.7	90.8	5.2
	2	112.5	8.9	108.6	8.7	115.8	7.2	106.0	3.5
Acid Green 9	200	70.7	2.5	72.3	2.1	75.3	6.3	81.4	6.2
	20	82.6	8.4	85.6	5.4	76.4	6.5	80.6	3.3
	2	63.7	5.3	70.5	3.6	69.2	4.6	79.8	9.0
Acid Violet 9	400	91.2	6.3	77.3	6.7	77.8	7.7	82.9	5.0
	40	88.9	3.9	80.6	7.0	79.5	6.2	88.6	6.1
	4	87.8	4.8	72.5	5.3	76.3	4.8	80.3	4.2
Acid Violet 43	200	108.1	7.7	86.6	1.6	105.0	4.9	97.3	7.0
	20	105.5	6.6	90.5	2.4	92.3	3.5	99.4	1.5
	2	95.4	5.2	81.3	2.2	96.8	8.7	90.5	2.3
Malachite Green Oxalate	20	77.2	4.4	76.4	7.9	79.4	10.5	75.9	2.5
	2	70.6	2.1	77.4	5.6	78.0	4.9	76.8	3.6
	0.2	64.4	1.8	74.1	5.6	72.2	8.5	68.2	4.7
Disperse Blue 3	200	113.7	6.5	97.6	7.9	99.7	6.7	105.5	6.1
	20	100.6	6.8	99.4	8.4	96.5	6.0	96.7	5.5
	2	98.2	5.4	95.1	4.9	91.7	4.8	92.8	2.8
Disperse Orange 11	400	89.8	3.4	78.2	4.2	79.2	3.1	78.3	3.8
	40	84.2	6.3	79.4	8.1	77.3	3.9	73.6	6.2
	4	80.2	5.3	82.1	6.6	77.0	5.1	71.9	3.5
Disperse Orange 37	20	86.3	4.6	87.8	4.9	101.3	11.1	101.6	6.7
	2	85.3	5.6	85.3	3.5	95.6	6.2	98.9	5.1
	0.2	84.5	6.2	84.3	4.0	94.3	4.1	92.0	6.2
Sudan Blue 2	20	75.0	0.8	73.6	3.9	71.2	2.2	80.6	3.9
	2	76.1	2.6	72.1	4.0	70.2	3.5	74.2	4.0
	0.2	71.2	3.5	70.0	2.1	62.1	4.5	73.4	5.8
Para Red	20	78.5	3.8	75.2	1.5	84.2	5.2	77.1	3.3
	2	76.8	3.2	71.5	6.4	80.6	4.9	75.6	5.1
	0.2	74.1	3.9	73.6	5.1	82.1	5.0	69.1	5.9
Sudan Red G	200	74.1	10.6	83.6	7.8	81.3	9.7	76.1	6.8
	20	76.5	6.5	82.1	8.4	91.9	7.4	72.6	5.6
	2	73.9	9.1	78.6	6.9	82.4	5.9	70.8	8.5
Sudan Red I	200	83.8	1.2	85.0	3.4	85.5	1.5	83.3	2.0
	20	90.6	2.5	86.2	3.6	85.4	2.5	84.2	3.9
	2	92.1	2.9	88.0	5.1	87.5	2.9	83.7	4.8
Acid Yellow 36	200	100.1	2.7	91.0	2.8	97.3	2.1	100.4	7.6
	20	90.6	5.2	92.5	3.0	95.8	3.5	95.6	5.9
	2	93.0	4.8	88.5	4.7	93.1	4.5	92.6	8.8
Acid Orange II	200	104.3	6.4	76.0	2.7	105.4	8.9	96.6	2.8
	20	96.6	4.0	80.1	5.8	93.5	4.9	96.0	11.5
	2	88.7	5.1	73.2	7.0	90.1	9.5	88.1	5.9
Disperse Yellow 1	400	77.6	3.9	78.4	7.2	99.4	12.1	98.5	8.5
	40	72.5	4.3	69.4	8.5	92.5	10.5	91.8	2.1
	4	69.4	4.1	75.5	7.2	88.0	9.8	87.6	4.5

表3 空白样品中24种工业染料的加标回收率和精密度(n=6) Table 3 Recoveries and RSDs for the 24 industrial dyes spiked in blank samples (n=6)

2.7 样品的测定

采用本方法分别测定了香肠等熟肉制品、粮食及粮食制品等样品中的24种禁用染料,结果均未检出。同时没有发现有杂峰干扰各个染料的检测。

3 结论

本文以两种食品为研究对象,建立了采用WAX固相萃取前处理技术、超高效液相色谱-串联质谱同时测定食品中24种禁用染料的方法。本方法检出限低,精密度高,可以同时在短时间内测定24种禁用染料,适用于粮食制品及肉制品中禁用染料的测定,能满足大批量样品的快速分析检测需求。

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... 包括免疫法^{[ 1 ]}、毛细管电泳法^{[ 2 ]}、电化学分析法^{[ 3 ]}、薄层色谱法^{[ 4 ]}、高效液相色谱法^{[ 5 ]}...

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... 包括免疫法^{[ 1 ]}、毛细管电泳法^{[ 2 ]}、电化学分析法^{[ 3 ]}、薄层色谱法^{[ 4 ]}、高效液相色谱法^{[ 5, 6, 7, 8, 9 ]}、气相色谱-质谱联用法^{[ 10 ]}和液相色谱-质谱联用法^{[ 11 ]}...

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...^{[ 9 ]}、气相色谱-质谱联用法^{[ 10 ]}和液相色谱-质谱联用法^{[ 11 ]}...

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