单克隆抗体类药物具有高度均一、特异性强、效价高、无交叉反应性等诸多优势,已经发展成为生物药品领域中一大类重要的诊断和治疗剂[ 1, 2 ]。目前国内外制药厂家多使用动物细胞反应器生产重组单克隆抗体,所得产品结构准确、活性高,已经得到了医疗行业的认可[ 3 ]。然而,该方法成本非常高昂,从而在一定程度上限制了单克隆抗体在医药领域的广泛应用。新兴的乳腺生物反应器技术同样可以生产高活性的单克隆抗体产品[ 4 ],而且具有表达量高、成本低廉、产品开发周期短等优势,已经迅速成为单克隆抗体药物开发、生产的重要组成部分[ 5, 6, 7 ]。我国研究者已经成功地利用牛乳腺生物反应器表达了人CD20单克隆抗体[ 8 ],有望在不远的将来占据一定的市场份额。然而,下游的分离纯化步骤依然是限制该类产品大规模应用的瓶颈步骤。
重组牛乳中的蛋白质杂质种类较多,包括牛自身表达的多克隆抗体。牛抗体(bovine IgG, BGG)会导致部分人群的过敏甚至免疫混乱,因此需要严格限制其在纯化所得重组人抗体(recombinant human IgG, rHGG)蛋白质产品中的含量。然而,牛抗体与重组人抗体的结构以及物理、化学性质均非常相似,分离难度很大,从而对重组抗体的分离纯化提出了严峻的挑战。Grunfeld等[ 9 ]采用混合模式的色谱技术分离混合抗体,取得了一定的分离效果。但实验结果表明,这种利用抗体疏水性进行分离的方法通用性有限,无法解决所有混合抗体分离的问题。此外,Pollock等[ 10 ]提出了可通过亲和色谱分离纯化乳腺生物反应器表达的重组抗体分子,但并未报道其产品中动物抗体的残留量。
在本文中,首先对重组人抗体和牛抗体之间的种属差异进行了分析,并在此基础上设计了通用性更强的分离方案。针对抗体分子重链上存在种属特征序列的特点,构建了两套分离方案,分别使用商品化的Protein A亲和介质和自制免疫亲和介质用于同源抗体的分离,并讨论了两种分离模式对Protein A色谱分离同源抗体效果的影响。最终建立可以彻底分离混合抗体的分离策略。该方法操作简单,易于放大,可以为乳腺生物反应器表达重组抗体的规模化生产提供有效的支持和参考。
KTA液相色谱系统和Ultraspec 2000紫外-可见分光光度计、XK 16/20色谱柱(GE Healthcare公司); Model 450酶联免疫检测仪、Mini-PROTEAN Tetra System电泳仪(美国Bio-Rad公司); TGL-16M高速台式冷冻离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司); Milli Q Plus超纯水机(美国Millipore公司);色谱柱:150 mm×10 mm(上海锦华色谱设备厂)。
重组人CD20抗体奶粉(中国农业大学); Bovine IgG试剂盒和Human IgG试剂盒(上海研辉技术有限公司); Protein A亲和介质(中国科学院过程工程研究所工程中心);化学试剂均为国产分析纯试剂。
将重组人CD20抗体奶粉放在4 ℃下保存。重组人CD20抗体奶粉预处理:按1 ∶ 15的质量比将其溶于纯水中;于 10000 r/min、4 ℃下离心30 min,弃去上层油脂得到脱脂乳;调节脱脂乳pH=4.6,静置2 h后再次于 10000 r/min、4 ℃下离心30 min,弃去下层酪蛋白沉淀,得到含有重组人CD20抗体的乳清。
羊抗人单抗亲和色谱介质的制备:取5 mL左右的琼脂糖白球介质,用去离子水抽洗干净,将抽干的白球介质放入锥形瓶中,按1 ∶ 3 ∶ 1的质量比加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚和1.5 mol/L 氢氧化钠溶液(含介质体积0.33%的硼氢化钠),在水浴摇床中进行环氧活化反应。取出活化后的介质抽洗至pH中性,介质抽干后重新放入清洗过的锥形瓶中,按1 ∶ 6的质量比加入羊抗人免疫球蛋白进行偶联配基反应(条件:37 ℃、120 r/min、24 h)。偶联后介质用去离子水清洗并抽干,使用1 mol/L 乙醇胺溶液(pH 11.0)封闭(条件:37 ℃、140 r/min、4 h)。抽洗干净封闭后介质中的乙醇胺(水洗-酸洗-水洗-碱洗-水洗),将抽干后的羊抗人单抗亲和色谱介质保存在20%乙醇中待用。
羊抗人单抗亲和色谱:柱体积(CV)5 mL,使用A液(20 mmol/L 磷酸缓冲液,pH 7.0)平衡色谱柱后,进样流速0.25 mL/min,继续用A液淋洗至基线平稳;使用B液(20 mmol/L 柠檬酸缓冲液,pH 2.7)进行洗脱,流速1 mL/min,测定收集的重组人CD20抗体的含量和牛抗体的含量。
Protein A亲和色谱柱,CV 5 mL,使用A液平衡色谱柱后,分别进样1/5倍柱体积(1 mL)、2/5倍柱体积(2 mL)、1倍柱体积(5 mL)、2倍柱体积(10 mL)和4倍柱体积(20 mL)的重组人CD20抗体乳清,流速0.5 mL/min;进样后继续用A液淋洗至基线平稳,洗去未结合的杂质;使用B液进行洗脱,流速1 mL/min,收集洗脱峰并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析以测定蛋白纯度,采用试剂盒双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)测定重组人抗体的含量和牛抗体的含量。
采用底物显色法检测收集的各峰中BGG含量,每次试验都需建立BGG标准曲线。每个样品孔中预先包被牛免疫球蛋白G抗体,作为探针,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体,用底物四甲基联苯胺(TMB)显色,底物在HRP催化下显色,通过酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值(OD值),计算样品浓度,从而测定BGG的含量。
采用底物显色法检测收集的各峰中rHGG含量,每次试验都需建立rHGG标准曲线。每个样品孔中预先包被重组人免疫球蛋白G抗体(作为探针),加入HRP标记的检测抗体,用底物TMB显色,底物在HRP催化下显色,通过酶标仪在450 nm波长下测定OD值,计算样品的浓度,从而测定rHGG的含量。
参照考马斯亮蓝法,根据牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的标准曲线计算得出原料及色谱峰中蛋白质的含量。
采用SDS-PAGE分析:样品中加入2%巯基乙醇,于100 ℃下煮沸3～5 min,在15%的分离胶中电泳,蛋白质进样量2 μ g,染色方法采用银染。
前期采用文献[ 9 ]报道的疏水色谱方法分离乳清原料中的重组人CD20抗体和牛抗体,但是分离效果不佳。这是由于针对不同抗原的重组人抗体的疏水性存在差异,文献报道的疏水方法无法适用于所有重组人抗体的纯化,其通用性有限。只有从抗体分子的结构入手,才能开发出通用性更强的混合抗体分离技术。抗体分子可分为恒定区和可变区,同一物种来源抗体分子的恒定区非常保守,氨基酸序列完全一致;不同物种来源的抗体分子恒定区存在显著差异,可以根据该差异区域对重组人抗体和牛抗体进行分离。基于这一研究思路,设计了两条分离工艺路线,分别使用Protein A亲和色谱和自制的免疫亲和色谱进行了分离实验。
Protein A亲和介质可以利用配基与抗体恒定区之间的亲和力进行分离纯化。人抗体与牛抗体恒定区的种属差异导致它们与Protein A配基之间的亲和力强弱存在一定的差异[ 11 ],可以实现上述的研究思路。文献[ 12 ]也证实,使用Protein A亲和色谱可以有效地分离混合抗体。因此本文首先使用Protein A亲和色谱结合常规线性梯度洗脱(10倍柱体积洗脱液中A液从0%到100%)的方式对样品进行分离,结果如图1所示。电泳结果(图2)表明,Protein A色谱可以有效地纯化抗体,洗脱峰电泳纯度大于95% 。但是,ELISA检测结果(表1)表明洗脱峰中同时存在重组人CD20抗体和牛抗体,且牛抗体的含量较高(17.1% ),没有达到预期的分离混合抗体的效果。
实验中优化了Protein A色谱分离工艺,使用置换色谱模式分离混合抗体。置换色谱是一种常用的色谱方式,它利用混合蛋白质竞争性地结合在固定相上来分离纯化蛋白质,可以在离子交换、亲和色谱以及疏水色谱等多种色谱柱中使用[ 13 ]。根据文献报道,置换色谱模式适合分离物理、化学性质非常接近的蛋白质混合物,研究者已经将该分离模式应用于自上而下的蛋白质组学的分离纯化,并取得了不错的效果[ 14 ]。
考察了进样量对置换色谱分离效果的影响。分别进样1、2、5、10、20 mL乳清,收集各批次的洗脱峰,使用SDS-PAGE检测纯度并使用ELISA分析洗脱峰中牛抗体的残留量。如图3所示,进样量不会影响色谱产品的纯度,实验所得洗脱峰的纯度达到了电泳纯。ELISA及蛋白质含量分析结果如表2所示。随着进样量的增加,洗脱峰中的牛抗体残留率逐渐减少,当进样量增加到20 mL时,牛抗体残留率降至0.82% ;结合电泳分析结果可知,此时洗脱峰中的重组人CD20抗体纯度可以达到95%以上。
上述Protein A置换色谱可以有效地分离重组人抗体和牛抗体,但是其通用性仍然受到一定的限制。举例来说,兔源IgG同Protein A之间的亲和力与人源IgG非常相似,因此兔乳腺生物反应器表达的重组人抗体无法使用上述方案进行分离。为此,设计合成了通用性更强的免疫亲和色谱介质用于解决混合抗体的分离。免疫亲和配基为针对目标抗体种属特征区域的单克隆抗体,仅能结合该物种来源的抗体,而不能结合其他物种来源的抗体,从而实现混合抗体的分离。
在本文中,以羊抗人单抗为亲和配基合成了免疫亲和介质用于重组人CD20抗体和牛抗体的分离,结果见图4。使用ELISA检测了洗脱峰组分,并计算了色谱纯化倍数,结果如表3所示,洗脱峰中牛抗体含量很低(0.2% );结合SDS-PAGE纯度检测结果(见图5)可知,重组抗体产品的纯度大于95% 。
Grunfeld等[ 9 ]首先报道了利用重组人抗体和牛抗体的疏水性差异进行分离的案例,但是本研究的前期实验结果表明,该方法通用性不强,无法适用于所有的重组人抗体。为了适应乳腺生物反应器产业化的需求,有效地纯化重组动物乳液中的人抗体产品,需要找到通用性更强的分离纯化方法。本文针对抗体分子恒定区的结构特点,设计了两套分离方案并对此进行了探索。
Pollock等[ 10 ]曾经使用亲和色谱分离乳腺生物反应器表达的重组抗体,但并没有对其产品中的动物抗体残留进行报道,也没有深入地研究重组抗体在亲和色谱过程中的分离机理。在本文中,通过实验考察了重组抗体和动物抗体在亲和色谱中的分离机理,并对此方法的色谱条件、分离抗体的纯度和回收率等进行了深入的研究。Protein A亲和色谱是一种常用的纯化抗体的手段,可以高效地分离纯化抗体。本文进一步开发了该色谱技术的潜力,利用不同种属抗体分子与Protein A之间亲和力的差异来分离混合抗体。当进样量较小时,Protein A介质的有效吸附位点比较充足,重组人抗体和牛抗体都吸附到介质上,此时只能以梯度洗脱的方法进行分离。由于人抗体和牛抗体之间的性质差异不大,相应的最佳洗脱梯度间隔较小,在实际的梯度洗脱过程中往往由于柱效的原因,难以实现有效的分离。
随着色谱进样量的增加,抗体分子数量逐渐多于介质的有效吸附位点,此时人抗体和牛抗体在亲和柱上发生竞争性吸附。由于人抗体与Protein A配基之间的亲和力更强,因此在竞争过程中占据优势地位,逐渐置换弱吸附的牛抗体而结合在色谱柱上,被置换下来的牛抗体流穿,然后将吸附到柱上的人抗体洗脱下来,即可实现混合抗体的分离。
在置换色谱模式中,进样量对分离效果的影响非常关键。如果进样量过小,置换过程不彻底,那么所得洗脱峰中牛抗体杂质含量可能超标,无法得到合格的重组抗体产品;如果进样量过大,则重组抗体可能大量流穿,造成分离纯化过程中目标产品收率过低。因此在使用置换色谱分离混合抗体时,重点需要对进样量进行优化。
值得指出的是,不同动物来源的抗体与Protein A介质之间的亲和力存在显著差异,Protein A色谱方法虽然可以有效地分离重组人抗体和牛抗体,但并非适用于所有动物乳腺生物反应器产品的纯化。例如,兔抗体与Protein A之间的亲和力非常强[ 11 ],与人抗体相当,如果使用兔乳腺表达重组人抗体,则无法采用该策略进行混合抗体的分离。
本文开发的免疫亲和色谱是一种通用性更强的混合抗体分离策略。该技术采用针对人抗体种属特征区域的单克隆抗体为配基合成免疫亲和介质,分离混合抗体。由于亲和配基仅能结合人抗体,因此该技术可以广泛应用于所有动物乳腺生物反应器表达重组人抗体的分离纯化,通用性极强。目前,该色谱技术尚存在目标产品回收率较低等缺陷,这主要是由于重组人抗体和亲和配基之间的亲和作用力过强,常规方法难以顺利地将其洗脱所致。拟在将来进一步研究洗脱方法,以提高重组产品回收率,完善该色谱分离策略。
针对重组动物乳液中混合抗体分离问题,本文开发了两种亲和色谱分离策略并比较了其分离效果和通用性。结果表明,使用Protein A色谱结合梯度洗脱可以有效地纯化得到混合抗体,但是无法分离重组人CD20抗体和牛抗体;Protein A色谱结合置换模式的分离度更高,在合适的进样量条件下可以有效地分离重组人CD20抗体和牛抗体,从而得到高纯度的重组目标产品。该方法具有一定的通用性。免疫亲和色谱同样可以完成分离动物抗体-重组人抗体混合物的任务,且其通用性更强,可以应用于任何动物乳腺表达重组人抗体的分离纯化中。
2013, Vol. 31 Issue (10): 974-979
PDF (1221KB)
2013, Vol. 31 Issue (10): 974-979
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