中药是中华民族的瑰宝,历史悠久,品种繁多,其常用的鉴别方法主要包括性状鉴别、显微鉴别[ 1 ]及理化鉴别[ 2 ]等,其中性状和显微鉴别在很大程度上依赖于鉴定者的实践经验,有一定的主观性,尤其对一些近缘品种和易混淆品种的鉴别难度较大。而常用的理化鉴别方法有化学法、光谱法[ 3, 4 ]等。化学法多用于鉴定中药中是否含有某一类物质(如多糖等),一般需要与显微鉴别等方法共同使用[ 5 ]。光谱法如近红外光谱法,存在谱图信息量大,解析较复杂等问题。 目前中药鉴定主要针对中药中的小分子组分,多采用色谱技术,如薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法和毛细管区带电泳法(CZE)等。
中药多糖除了可作为能量物质外,还具有重要的生物活性,如免疫调节功能[ 6, 7, 8, 9 ],抗炎、抗衰老、抗肿瘤、抗凝血、降血糖及预防等作用[ 10, 11, 12 ]。多糖在中药中含量较大,其结构具有复杂性和特征性。现有的中药多糖鉴定方法主要为薄层色谱法[ 13 ]和红外光谱法[ 14 ]。薄层色谱法具有简单、快速、成本低等优点,但因其目前主要针对多糖降解后的单糖进行分析,往往很难鉴别单糖组成相似的中药多糖。红外光谱法具有测定快速、官能团鉴别专属性强等优点,但其灵敏度较低,因多糖结构相似样品的大部分特征峰频率的位置相近,难以进行中药品种的准确鉴别。
本文对多糖部分降解后的寡糖进行检测,基于中药指纹图谱的鉴别原理,探讨其作为中药鉴定手段的可行性。本研究选取3个科属的6种中药,即功效相近、临床上易于混用的黄精和玉竹[ 15 ],免疫活性相反的北沙参和天门冬[ 16, 17, 18 ]及同一科属的南沙参[ 19 ]和党参[ 20 ]作为研究对象(其中北沙参为伞形科植物,党参和南沙参为桔梗科植物,黄精、玉竹和天门冬为百合科植物)。提取相关中药的多糖成分后,对其部分酸降解的寡糖片段进行CZE分离,以寡糖的CZE图谱作为该中药的特征信息,结合聚类分析进行易混中药的鉴别研究。
CL1020高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司);未涂层熔融石英毛细管柱(河北永年锐沣色谱器件有限公司); PHS-3C型酸度计(上海理达仪器厂); AG204电子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司); L500低速自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司); TG16-W微量高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司); RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂); SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(保定高新区阳光科教仪器厂)。
1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP,日照力德士化工有限公司); Sevage试剂(氯仿-正丁醇(4 ∶ 1, v/v));氢氧化钠、盐酸、磷酸二氢钠、甲醇、正丁醇和氯仿等均为分析纯;所用水为去离子水。
北沙参、党参、南沙参、天门冬、玉竹和黄精6种药材购自当地3个药店，所有药材均经保定市药品检验所田桂敏副主任药师鉴定。18个样本的中药名称及相应编号见表1。
未涂层熔融石英毛细管柱(49 cm(有效长度40 cm)×50 μ m),以50 mmol/L 磷酸盐缓冲液(磷酸调pH值至2.5)为运行缓冲液;检测波长为245 nm;运行电压为15 kV;虹吸进样10 cm×4 s;柱温为室温[ 21 ]。
毛细管柱在进样分析前,依次用已过滤的1 mol/L 氢氧化钠溶液、水及运行缓冲液各冲洗10 min。进样前,各样品溶液均超声脱气2 min。
分别称取购自3家药店的北沙参(或党参、南沙参、天门冬、玉竹、黄精)20 g,加入200 mL水,浸泡过夜。水浴加热,提取2 h,过滤；残渣中加入150 mL水提取1.5 h，过滤；残渣中再加入100 mL水提取1 h,过滤；合并3次提取液,浓缩至约25 mL。
浓缩液中加入133 mL乙醇使含醇量达80% ,静置8 h,于4 000 r/min下离心5 min,弃去上清液,将沉淀移至烧杯中，加入40 mL水复溶。
将上述溶液与8 mL Sevage试剂混合,磁力搅拌20 min, 于4 000 r/min下离心5 min,取上清液再重复上述操作1次。将第二次除蛋白后的上清液浓缩至约25 mL,然后加入133 mL乙醇进行二次醇沉,离心,取下层沉淀,置于烘箱中于60 ℃下干燥,得到多糖固体。将其研磨成粉,备用。
称取北沙参(或党参、南沙参、天门冬、玉竹、黄精)多糖粉末0.01 g,加入0.4 mL 0.3 mol/L 盐酸溶液,于85 ℃下反应3 h，取出后冷至室温,加入0.4 mL 0.3 mol/L 氢氧化钠溶液中和。
取上述多糖降解溶液0.2 mL,加入0.1 mL 0.3 mol/L 氢氧化钠溶液和0.1 mL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液,涡旋混匀,于70 ℃水浴中加热30 min，取出后冷至室温,加入0.1 mL 0.3 mol/L 盐酸溶液中和,并加入1 mL氯仿,振荡1 min,除去过量的PMP,于 12 000 r/min 下离心1 min。取上层溶液进行CZE分析。
以酸浓度、降解温度及降解时间3因素对北沙参多糖采用正交设计进行降解优化,以谱图特征性(峰数及其比例)最强为指标,得到1.3.4节中所选用的降解条件。6种中药的多糖均在上述降解条件下进行降解,衍生后进行CZE分析。3个科属的中药谱图分别见图1～图3。
分别称取7号多糖样品5份,按所建立的方法操作,制备供试品溶液并进行CZE分析。记录各峰的峰面积,计算2号、4号峰峰面积与1号峰峰面积比值的RSD值分别为1.8%和5.0% ,表明所建立的方法重复性良好。
本研究以15个特征峰面积为参数(PMP峰为所有谱图的共有峰,以此峰为参照峰,计算各组分峰与PMP峰的迁移时间比,按由小到大的顺序确定峰序号),对上述18个CZE谱图运用Minitab 16软件,以Manhattan为距离量度进行观测值聚类分析,结果显示:距离为1.56时7、8、9号样品归为一类,距离为2.33时13、14、15号样品归为一类,距离为3.42时4、5、6号样品归为一类,距离为4.19时16、17、18号样品归为一类,距离为9.83时10、11、12号样品归为一类,距离为10.96时1、2、3号样品归为一类,距离为8.32时4～9号样品归为更大一类,距离为105.81时所有样品归为一类(此处样品编号顺序与谱图中的一致)(见图4)。采用Matlab软件对聚类分析结果进行计算,得cophenetic相关系数为 0.921 9,结果表明聚类结果良好。
本实验也曾采用欧氏距离进行观测值聚类分析,结果并不理想,故最终选择Manhattan为距离量度。
由图2和图3可知,同科属中药的寡糖CZE谱图虽略有不同,但十分相似。如图4所示,4～9号样品又可以归为一大类,即桔梗科类植物。本方法不仅可以对同源性较远、免疫作用相反的北沙参(见图1)与天门冬(见图3)进行鉴定,也可以对同源性较近、功效类似、临床易混用的中药进行鉴定,如黄精和玉竹(见图3)。该方法在中药鉴定中显示了良好的应用前景。
中药多糖在相同条件下部分酸降解后,以PMP为衍生试剂,采用CZE分析,得到中药寡糖的特征性CZE图谱;结合聚类分析可有效鉴定易混中药材,尤其适用于同科属易混中药的鉴定。
同时,由上述实验结果可见,同一科属、不同来源的中药很可能含有结构相近的寡糖片段或种类相同的多糖重复结构,这为中药寡糖的药源开发提供了依据和新途径。例如巴戟天寡糖具有确定的抗抑郁作用,我们可以在巴戟天同属茜草科的其他植物中寻找具有相同疗效的药源,进一步开发新的抗抑郁寡糖类药物。
2013, Vol. 31 Issue (10): 1001-1004
PDF (799KB)
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