超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(美国Agilent公司);高速均质机(美国Waring公司);离心机(美国Sigma公司);漩涡混匀器(德国IKA公司);旋转蒸发仪(日本EYELA公司); Milli-Q超纯水装置(美国Millipore公司)。

3种原多甲藻酸标准品AZA-1、AZA-2和AZA-3(纯度均≥99.0% ,美国Supelco公司);乙腈、乙酸铵(色谱纯,美国Fisher公司);甲酸(色谱纯,美国Tedia公司);无水硫酸镁、氯化钠(分析纯,国药化学试剂公司); C₁₈ 分散固相萃取(DSPE)吸附剂(美国Agilent公司);微纤维滤纸(美国VICAM公司);微孔滤膜(0.2 μ m,美国Whatman公司);实验用水为经Milli-Q净化系统过滤的超纯水(电阻率为18.2 M Ω \5cm)。

用甲醇配制3种原多甲藻酸贝类毒素的标准储备液,于-20 ℃下保存,保存期为6个月;制作标准工作曲线时,根据要求将储备液稀释成不同浓度,于-20 ℃条件下保存。标准工作曲线现用现制作。

贻贝、牡蛎、象拔蚌和扇贝4种食用贝类及其制品购于北京某海鲜超市。

试样制备:用尖锐物品将试样去壳,将沙土及其他固体颗粒用清水冲洗去掉,沥干后称取200 g洗净的样品,置于洁净的密封袋中,放入-20 ℃的冰箱中保存,避免试样间的交叉污染(可直接食用的样品直接称取即可)。

提取和净化:准确称取制备好的试样10 g(精确至0.01 g)于均质杯中,分别加入25 mL 85%乙腈水溶液提取液、5 g无水硫酸镁和2 g氯化钠,在 20000 r/min 转速下均质60 s,用微纤维滤纸过滤;取10 mL滤液至离心管中,加入0.5 g C₁₈ DSPE吸附剂和1 g无水硫酸镁,漩涡振荡1 min,在 7000 r/min 转速下离心5 min,取5 mL上清液移至锥形瓶中,在40 ℃下旋转蒸发至近干,以0.8 mL乙腈和0.2 mL水溶解,漩涡振荡30 s,过0.2 μ m微孔滤膜,滤液待仪器分析测定。

选用不含上述3种原多甲藻酸的扇贝样品,分别添加3个水平(10、20和50 μ g/kg)的原多甲藻酸标准物质,按上述方法处理及测定,计算回收率。

用纯水代替试样,按照上述步骤进行空白试验。

由于AZAs在贝类的肌肉和内脏等组织中的富集程度各不相同,如AZA-1主要分布于消化腺,而AZA-3则主要分布于消化腺以外的其他组织^{[ 3 ]},因此在取样时,应取除外壳的整个部分(包含肌肉和内脏)作为试样,以确保样品的均一性和代表性。

原多甲藻酸贝类毒素是一类脂溶性聚醚化合物,易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂。试验分别考察了乙酸乙酯、甲醇、乙腈3种提取液的提取效率。试验结果表明乙腈的提取效率相对较好。但由于贝肉中富含大量的蛋白质、氨基酸等杂质,使用100%乙腈进行提取时,会增加粗提液中干扰杂质的含量,给净化步骤增加难度。因此,试验还比较了不同比例的乙腈-水体系的提取效果。结果表明,乙 腈-水(85 ∶ 15, v/v)混合液的提取效果最好(见表2)。

常见的样品提取方式主要有振荡提取、均质提取、超声提取等。试验分别考察了不同提取方式对提取效率的影响。结果表明均质提取的效果最好(见表2)。以AZA-1为例,采用均质提取比采用超声提取和振荡提取获得的回收率分别高29%和24% 。

提取温度和提取时间往往会对提取效果有一定的影响,因此试验考察了不同提取时间和提取温度对提取效果的影响。试验结果表明至少60 s才能够保证目标化合物的提取效率。此外,我们还考察了不同温度下的提取效果。结果表明,在室温、40 ℃和70 ℃下,目标化合物的提取效果并无明显差异(见表2),这说明温度对提取的影响不大。

通过正交试验最终确定的提取条件:室温条件下,以乙腈-水(85 ∶ 15, v/v)溶液作为提取液,采用高速均质仪器将样品均质60 s。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同提取条件下50 μ g/kg AZAs在牡蛎样品中的提取效率(n=6) Table 2 Extraction efficiency of 50 μ g/kg AZAs spiked in a oyster sample under different extraction conditions (n=6) μ g/kg Compound Extraction solution Extraction method Extraction time/s Extraction temperature/ ℃ Acetic ether Methanol Acetonitrile Acetonitrile-water (85 ∶ 15, v/v) Shaking Ultrasonic Homogeneity 20 60 120 Ambient 40 70 AZA-1 43.5 37.2 44.5 44.9 32.2 29.5 44.2 22.5 43.2 44.0 41.5 41.4 40.2 AZA-2 30.9 33.1 40.9 42.1 29.8 22.3 45.1 26.9 40.9 41.5 40.9 41.2 39.9 AZA-3 34.4 32.9 39.3 38.5 27.3 19.8 40.0 25.1 42.6 41.9 40.2 40.5 41.5

表2 不同提取条件下50 μ g/kg AZAs在牡蛎样品中的提取效率(n=6) Table 2 Extraction efficiency of 50 μ g/kg AZAs spiked in a oyster sample under different extraction conditions (n=6) μ g/kg

本实验以贝类样品的基质特点为基础,参照QuEChERS的基本原理，针对贝类产品及其制品的基质特点和目标化合物的特性,优化了适用的提取净化条件并得到了较为满意的结果。

为了提高提取效率,提取时加入了无水硫酸镁和氯化钠。无水硫酸镁能够帮助目标化合物在提取溶液中更好地分散,使提取更加容易;氯化钠则能够使溶液体系中的水趋于相饱和,促使目标化合物分散至有机相并有助于水相和乙腈相分层,从而提高提取效率^{[ 25, 26, 27, 28, 29 ]}。试验分别考察了无水硫酸镁和氯化钠的加入量对AZAs提取效率的影响。结果表明,5 g无水硫酸镁和2 g氯化钠的加入即能够获得较好的提取效率。其中对AZA-1提取效率的影响见图1。

图1

Fig. 1

图1 (a)MgSO4和(b)NaCl加入量对4种贝类产品基质中添加50 μ g/kg AZA-1提取效率的影响 Fig.1 Effects of addition of (a) MgSO4 and (b) NaCl on the extraction efficiency of AZA-1 spiked at 50 μ g/kg in four shellfish matrices

分析测定常用的净化方法主要有液-液萃取、蛋白质沉淀、凝胶净化、固相萃取等,其中固相萃取技术是近年来食品分析中最常见的一类净化方法。随着固相萃取技术的发展,涌现出一些新型的固相萃取技术,如固相微萃取(SPME)、搅拌棒吸附萃取(SBSE)、基质DSPE、分子印迹固相萃取(MISPE)、 免疫亲和固相萃取(IASPE)、整体柱固相萃取(monolithic SPE)、碳纳米管固相萃取(CNT SPE)等^{[ 30 ]}。这些净化技术各有优点，具有各自适合的应用范围，且不同的吸附剂填料也对净化效果有显著的影响。Florisil硅土作为强极性吸附剂,无法去除提取液中的脂类杂质,AZAs的回收率偏低;石墨化碳(GCB)通常用于去除色素成分,并且对含苯环官能团的化合物具有较强的吸附作用^{[ 31 ]};N-丙基-乙二胺(PSA)能有效去除基质中的脂肪酸和甾醇类基质,但考虑到PSA作为碱性吸附填料会对AZAs这类酸性化合物有较强的吸附作用,因此使用时需添加一定量的酸以减少损失^{[ 32 ]}; C₁₈吸附剂可有效去除脂类、糖类等亲脂型杂质,对AZAs这类化合物的适用性较好,但过量的C₁₈吸附剂也会吸附目标化合物而使回收率降低,因此需要对C₁₈吸附剂的使用量进行优化。几种吸附剂各有特点,而我们需要在检测灵敏度、最佳净化效果和合理回收率之间寻求平衡点。本实验采用了DSPE技术进行净化处理,试验通过优化最终确定了使用C₁₈吸附剂(按照实验确定的最终前处理步骤,每20 g样品中加入1 g吸附剂),并配以1 g无水硫酸镁可以达到较好的净化效果。

为了获得最好的色谱分析效果,考察了乙腈-水和甲醇-水两种混合溶剂体系作为流动相时目标化合物的色谱保留行为。结果表明,使用甲醇-水体系作为流动相时,85%以上比例的甲醇才可将目标化合物洗脱下来,但当甲醇比例达到90%时,3种原多甲藻酸贝类毒素无法实现基线分离。而乙腈的洗脱能力较强,当采用乙腈-水体系作为流动相时,3种AZAs在7 min内即可实现基线分离(见图2)。

图2

Fig. 2

图2 采用乙腈-水体系作为流动相时3种AZAs的色谱图 Fig.2 Chromatogram of the three AZAs eluted with acetonitrile-water system as mobile phase

3种原多甲藻酸贝类毒素均在ESI⁺模式下电离,通过总离子流扫描可以看出,AZAs形成的准分子离子峰中[M+H]⁺峰的丰度最高。参考欧盟2002/657/EC指令^{[ 8 ]},以准分子离子为母离子进行二级质谱扫描,选择丰度较高的两个碎片离子作为定量和定性离子,分别优化各个离子对的锥孔电压(fragmentor voltage)及碰撞电压(collision voltage)。综合所有离子对获得最强响应信号时的质谱条件,优化了质谱载气温度及流量、鞘气温度及流量、雾化气压力、毛细管电压和喷嘴电压。这些参数中影响灵敏度的最主要参数是锥孔电压和碰撞能量,其中锥孔电压的高低影响母离子的传输效率:该电压过低,可能导致母离子传输效率低;但过高,会使母离子在传输过程中碎裂,从而降低目标离子的检测灵敏度^{[ 33 ]}。由于AZAs的质量数较大,因此锥孔电压应设置略高一些。3种AZAs碎裂后产生的主要碎片离子包含脱一个水分子、脱两个水分子的子离子和开环碎片离子。比较这些主要碎片离子的强度和稳定性,最终选择[M+H-H₂O]⁺和[M+H-2H₂O]⁺作为定量离子和定性离子。3种原多甲藻酸贝类毒素的质谱分析参数见表3,空白扇贝样品中添加标准品的MRM质谱图见图3。

图3

Fig. 3

图3 扇贝样品中添加水平为1 μ g/kg的3种AZAs的MRM色谱图和质谱图 Fig.3 MRM chromatograms and mass spectra of the three AZAs spiked in scallops at level of 1 μ g/kg

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 3种AZAs的质谱分析参数 Table 3 MS parameters for the three AZAs Compound Precursor ion (m/z) Fragmentor voltage/V Daughter ion (m/z) (collision voltage/V) Polarity AZA-1 842.5 190 824.5* (45) positive 806.6 (50) AZA-2 856.5 210 838.5* (45) positive 820.4 (50) AZA-3 828.4 200 810.4* (40) positive 792.4 (45) * Quantitative ion.

表3 3种AZAs的质谱分析参数 Table 3 MS parameters for the three AZAs

本方法应用QuEChERS净化技术结合超高效液相色谱-串联质谱建立了贻贝、牡蛎、蚌类、扇贝等可食用双壳贝类产品及其制品中3种原多甲藻酸贝类毒素的快速测定方法。与现有文献和技术相比较,该方法可同时分析3种原多甲藻酸贝类毒素(AZA-1～AZA-3);而且采用QuEChERS净化技术,操作简便,节约成本。同时,该方法在1～100 μ g/kg 范围内具有良好的线性相关性(r²＞0.995);检测灵敏度高,3种贝类毒素的定量限(S/N=10)均为1.0 μ g/kg;回收率和精密度高,样品基质中3个添加水平的回收率均在71% ～108%之间,RSD≤10%(n=6)。本方法的定量限能够满足国内外对该类项目的限量要求,适用于分析和测定食用贝类及其制品中的原多甲藻酸贝类毒素。