Trace GC Ultra气相色谱,TSQ Quantum GC三重四极杆串联质谱仪(美国Thermo Fisher公司),配AI/AS 3000自动进样器;Talboys数显型多管式旋涡混合器(美国Talboys公司);高速冷冻离心机(德国Sigma公司); TurboVap LV型氮吹浓缩仪(瑞典Biotage公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

乙腈、甲苯、丙酮、正己烷(均为色谱纯,美国J. T. Baker公司);氯化钠(分析纯);无水硫酸镁(分析纯,天津北方试剂公司,500 ℃马弗炉内烘5 h,冷却后置于干燥器内备用); PSA吸附剂、碳18(C18E)吸附剂(均购自美国Supelco公司);实验用水为Milli-Q超纯水系统所制超纯水。

155种农药标准品及三苯基磷酸酯(TPP，内标)标准品(纯度＞92% ,德国Dr. Ehrenstorfer公司)。

各农药单标准储备液:准确称取10.0 mg(精确到0.1 mg)标准品,置于10 mL容量瓶中,用甲苯溶解定容(若有目标物不溶时,可加入丙酮或甲醇助溶),配制成质量浓度为 1000.0 mg/L 的单标准储备液,贮存在-20 ℃冰箱中备用。

混合工作储备液:分别取0.2 mL上述单标准储备液于100 mL容量瓶中,用甲苯稀释定容,配制成各农药组分质量浓度均为2.0 mg/L 的混合工作储备液,储存在2 ℃冰箱中备用。

内标工作液:用TPP作内标,按农药单标准储备液的配制方法,配成20.0 mg/L 的内标工作液,储存在2 ℃冰箱中备用。

标准溶液的配制:分别取2.0 mg/L 的混合工作储备液0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1 mL于10 mL容量瓶中,加入100 μ L内标溶液(TPP, 20.0 mg/L),用甲苯定容至10 mL,配制成2、5、10、20、50、100、200 μ g/L 的系列标准溶液。

3组基质匹配标准溶液的配制:对空白烟草样品,分别按1.2.1节、1.2.2节和1.2.3节方法进行前处理,不加内标。取1.0 mL样品提取液,氮气吹近干后用1.0 mL系列标准溶液进行复溶,其质量浓度分别为2、5、10、20、50、100、200 μ g/L。

烟草中的农药残留考察种类范围国际上以CORESTA 2008年的GRLs和CORESTA农药残留分学组每年组织的烟草农药残留分析的国际共同实验的农药名单为主。我们前期已对这两部分农药进行了考察,确定了132种农药目标物可在GC-MS/MS上响应良好,而利用1.2.1节的溶剂转换方法可对其进行准确定性和定量分析,在50、200、500 ng/g的加标水平下,大部分目标物的回收率都在70% ～120%之间,相对标准偏差小于20% 。在已有基础上,增加了对我国烟草禁用农药名单和我国烟草推荐使用农药名单中的部分目标物的考察,最后确定155种目标物用来作为3种不同前处理方法对比的参数指标。其中,包含有机磷农药58种,有机氯农药28种,拟除虫菊酯类农药10种,酰胺类农药10种,氨基甲酸酯类农药11种,二硝基苯胺类农药7种和其他种类(包含唑类、脲类、杂环类等)目标物31种。

基质效应一般是指相同浓度的目标物在纯溶剂中和基质中的响应存在较大差异,而对于气相色谱,主要以基质增强效应为主^{[ 13, 14 ]}。在不含基质时,目标物易与进样口和色谱柱上的活性位点结合,从而使到达检测器的目标物含量降低;而在有基质存在时,基质可与这些活性位点结合,使得进入离子源的目标物相对增加,产生基质增强效应。而不同目标物、不同基质以及不同的仪器状态下,其基质效应也差别较大。例如,一些带有羟基、氨基和磷酸基团的农药目标物,其基质增强效应一般比有机氯农药强^{[ 15 ]};一些较干净的水果和蔬菜,如苹果,其基质效应较小,而对于茶叶和烟草等复杂样品,其基质效应也较强。

减小基质效应影响的方法一般有:加入同位素标记的目标物;更多的净化步骤或进样前稀释;基质匹配标准溶液;分析物保护剂的加入等。其中,同位素标记物的种类少,价格昂贵,应用不多;而更多的净化和稀释会增加样品前处理步骤,不仅耗时费力,减少目标物的覆盖范围,而且可能使目标物的定量限偏高,从而使其灵敏度降低。应用最多的是用基质匹配标准溶液建立标准工作曲线,对基质效应进行校正。

155种农药目标物在采用3种不同前处理方法得到的萃取液中的基质效应见图1。

图1

Fig. 1

图 1 155种农药目标物在采用3种提取方法得到的 烟草提取液中的基质效应 Fig. 1 Matrix effects of the 155 pesticides in tobacco extracts with three extraction methods OP: organophosphorus; OC: organochlorine; PY: pyrethroid; AM: acyl amide; CB: carbamate; DN: dinitroaniline; Others: azole, heterocycle, ureas et al.

由图1可知,大部分目标物在烟草提取液中均呈现显著的基质增强效应(ME＞50%^{[ 16 ]}),这是由烟草基质的复杂性决定的。3种前处理方法中,溶剂转换法得到的提取液的基质效应最强(对几种不同种类的目标物都是如此),表明其基质含量最大;而提取液稀释法和正己烷液液萃取法由于共萃取基质含量较少(见图2),故基质效应相对较弱。

图2

Fig. 2

图 2 初级萃取液及采用3种前处理方法净化后的取液中的共萃取基质的含量 Fig. 2 Amounts of co-extractives in initial extract and final extracts obtained with three sample treatment methods

在这几类农药目标物中,有机氯和拟除虫菊酯类农药的基质效应相对较弱(基质效应范围分别为4% ～88%和38% ～117% );而有机磷、酰胺类和氨基甲酸酯类农药的基质效应较强(基质效应范围分别为40% ～323% 、48% ～268%和28% ～445% ),与文献^{[ 15 ]}报道相符。林丹和六六六在3种提取液中的基质效应均小于50% ,是基质效应相对最弱的目标物;丰索磷、蚜灭磷、异菌脲、甲硫威砜等农药的基质效应均接近或高于300% ,且一般在溶剂转换法中的基质效应相对最强。

基质效应会随仪器的状态而变化,在刚维护后的仪器状态(新色谱柱、新衬管和刚清洗过离子源)下,进样100次烟草萃取液,发现内标TPP的响应值先增加,后降低,其他目标物的响应变化类似。这可能是由于刚维护后进基质样品,系统内大量的活性位点被共萃取基质结合,从而使到达检测器的目标物增多(相对于标准溶液);而进样一定次数后,共萃取基质在系统内积累可能会形成新的活性位点,从而使到达检测器的目标物相对减少。故总体来讲,在刚刚维护后的仪器状态下,基质增强效应更明显。

另外,基质效应对目标物的回收率也有一定的影响。因为在烟草萃取液中大部分目标物都在GC-MS/MS上呈现基质增强效应,故若采用溶剂标准溶液建立标准曲线,那么目标物的回收率会偏高。若用外标法定量,由上文可知,目标物的响应会随仪器状态而变化,在没有内标进行校正的情况下,其回收率可能会偏高或偏低。因此,本文采用空白基质配制标准溶液,内标法定量,在一定程度上减弱了基质效应,同时也使回收率数据更加稳定。

为了使大部分农药目标物得到尽可能高的回收率,在QuEChERS多农药残留分析方法中一般用乙腈作为萃取溶剂,而且净化步骤一般用PSA等进行简单振荡吸附净化。对于烟草这种复杂基质来说,最后的提取液中就会含有较多的杂质,即共萃取基质。而共萃取基质在进样口、柱内和离子源处的累积又可能导致仪器的稳定性变差,缩短仪器的维护周期,使整个分析过程的成本增加、效率下降。

由图2可知,采用正己烷液液萃取方法得到的提取液中的共萃取基质含量最少,对仪器的污染程度也最小。对部分农药目标物,通过考察其在标准溶液中与不同方法得到的提取液中的提取离子色谱图来分析基质对目标物的干扰(见图3)。大部分目标物的提取离子色谱图与除草醚类似,其干扰较小。对于甲拌磷,由于正己烷液液萃取法得到的提取液中的共萃取基质含量最少,故其干扰也较小;而溶剂转换法和提取液稀释法得到的提取液,在目标物附近存在一定程度的色谱峰干扰。

图3

Fig. 3

图 3 除草醚和甲拌磷在(a)标准溶液和采用(b)溶剂转换法、(c)提取液稀释法和(d)正己烷液液萃取法得到的提取液中的提取离子色谱图 Fig. 3 Extracted ion chromatograms of nitrofen and phorate in (a) the standard solution and tobacco extracts obtained from different sample treatment methods — (b) solvent exchange, (c) toluene dilution and (d) hexane LLE

通过考察3种前处理方法对250 ng/g加标水平下目标物的回收率和精密度来对比分析不同方法的优缺点，结果见表2。可以看出，溶剂转换法和提取液稀释法均能使大部分(约150种)目标物的回收率保持在70% ～120% ;而正己烷液液萃取法中只有约100种目标物的回收率在70% ～120% ,其中回收率较差的目标物主要是一些有机磷、酰胺类和氨基甲酸酯类等极性目标物。这主要是因为正己烷是一种非极性溶剂,在液液萃取过程中即使有盐析作用的帮助,也很难把一些极性的目标物萃取出来。3种方法都能使大部分目标物的定量限(LOQ)(见表2)小于10 ng/g,满足烟草中农药残留检测的要求。

表 2 3种前处理条件下155种农药目标物的回e收率(n=6)、RSD和定量限 Table 2 Recoveries, relative standard deviations (RSDs) and limits of quantification (LOQs) of the 155 pesticides obtained with the three treatment methods *LOQ:S/N=10;**NR:no recovery.

表 2 3种前处理条件下155种农药目标物的回收率(n=6)、RSD和定量限 Table 2 Recoveries, relative standard deviations (RSDs) and limits of quantification (LOQs) of the 155 pesticides obtained with the three treatment methods

图4是155种农药目标物在标准溶液和3种方法处理后的烟草提取液的总离子流图。在10～15 min和30～35 min两个时间段内,溶剂转换法得到的提取液中谱图干扰最严重,正己烷液液萃取法得到的提取液最干净。

图4

Fig. 4

图 4 (a)155种农药的标准溶液(0.1 mg/L)和空白烟草加标样品(0.1 mg/L)经(b)溶剂转换法、(c)提取液稀释法和 (d)正己烷液液萃取法处理后得到的提取液的总离子流图 Fig. 4 Total ion chromatograms (TICs) of (a) a standard solution of the 155 pesticides at 0.1 mg/L and the extracts of blank tobacco samples spiked with standards at 0.1 mg/L obtained with (b) solvent exchange, (c) toluene dilution and (d) hexane LLE methods

详细对比3种方法的操作步骤和优缺点,具体情况如下。

溶剂转换法:耗时50～60 min;对150种目标物可保证回收率70% ～120% ,最后进样溶液为正己烷-丙酮(9 ∶ 1, v/v),极性较小;但是氮吹步骤增加前处理时间,且氮吹过程中部分低沸点目标物易损失。

提取液稀释法:耗时35～40 min;对150种目标物可保证回收率70% ～120% ,前处理时间最短,操作最简单;但是上机溶液极性较大,且目标物的定量限可能会升高。

正己烷液液萃取法:耗时40～45 min;不需要净化步骤,节省操作,得到的提取液中共萃取基质含量最少;但只有约100种目标物回收率在70% ～120%之间,且液液萃取步骤较繁琐。

对于有机磷目标物,正己烷液液萃取法不能保证回收率,溶剂转换法因为有氮吹步骤,在前处理过程中可能会造成极性较大目标物如乙酰甲胺磷、甲氟磷的损失,故推荐使用提取液稀释法。对于酰胺类和氨基甲酸酯类农药,通过对比回收率和定量限数据,发现溶剂转换法和提取液稀释法相差不大。对于有机氯、菊酯类和二硝基苯胺类目标物,3种方法都能保证回收率,但正己烷液液萃取法的共萃取基质最少,故推荐使用。