Quattro Premeier XE三重四极杆液相色谱-质谱联用仪(美国Waters公司),配有电喷雾离子(ESI)源;Milli-Q Gradient超纯水系统(美国密理博公司); MTN-2800W氮吹浓缩装置(天津奥特赛恩斯公司);旋涡混匀器(上海精科实业有限公司);冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司);全能高速冷冻离心机(美国ThermoFisher公司);超声波清洗仪(天津市奥特赛斯公司);水系0.22 μ m聚醚砜滤膜(德国Membrana公司);有机系进口尼龙66滤膜(英国Navigator公司); Oasis HLB固相萃取柱(6 mL/500 mg, Waters公司)。

标准品:土霉素(oxytetracycline, OTC)、四环素(tetracycline, TC)、金霉素(chlortetracycline, CTC)、磺胺二甲嘧啶(sulfadimidine, SM2)、诺氟沙星(norfloxacin, NOR)、环丙沙星(ciprofloxacin, CIP)、洛美沙星(lomefloxacin, LOM)购于中国药品生物制品检定所;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸(色谱纯,Fisher公司);柠檬酸、磷酸氢二钠、EDTA钠盐、NaOH等试剂均为分析纯;实验用水为超纯水。

标准溶液配制:准确称取各种抗生素标准品10.0 mg各置于10 mL容量瓶中,四环素类化合物、磺胺二甲嘧啶4种抗生素用甲醇溶液溶解定容,喹诺酮类化合物用0.1 mol/L 氢氧化钠-甲醇(体积比为1 ∶ 99)溶解定容,得到质量浓度为1.0 g/L 的标准储备液,并储存于4 ℃冰箱中。准确移取各种单标准储备液,用甲醇-水(体积比为2 ∶ 8)稀释标准储备液配制成四环素类化合物和喹诺酮类化合物浓度范围为50～1 000 μ g/L、磺胺二甲嘧啶浓度范围为5～100 μ g/L 的混合标准溶液,避光置于4 ℃冰箱中保存,待用。

McIlvaine-Na₂EDTA缓冲液:将0.1 mol/L 柠檬酸溶液和0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液(体积比为8 ∶ 5)混合,用0.3 mol/L NaOH调节溶液pH值至4.00±0.05,得到McIlvaine缓冲液,再根据文献^{[ 1, 2, 3 ]}制备含有0.1 mol/L 的EDTA二钠盐的McIlvaine缓冲液。

将采集的新鲜猪粪、鸡粪,冷冻干燥后,粉碎并过0.25 mm筛。准确称取1.000 g样品,加入20 mL的甲醇-乙酸-水(6 ∶ 3 ∶ 1,体积比)溶液,涡旋振荡1 min,常温下超声20 min,在4 ℃下以 10 000 r/min 离心10 min,然后准确吸取10.0 mL上清液于试管内,弃去所剩上清液,再加入20 mL的甲醇-乙酸-水(6 ∶ 3 ∶ 1,体积比)溶液,重复上述操作后再吸取10.0 mL上清液于试管内,再次弃去所剩上清液,再加入10 mL的甲醇-乙酸-水(6 ∶ 3 ∶ 1,体积比)溶液,同样上述操作后,吸取5.0 mL上清液于试管内。将3次的上清液合并,充分混合后,取5 mL提取液用超纯水稀释，使提取液的甲醇含量低于10% ,过固相萃取小柱,用甲醇洗脱,氮气吹干,用0.3%(体积分数)甲酸水溶液定容,过滤膜,供HPLC-MS/MS测定。

色谱条件:Symmetry C₁₈色谱柱(150 mm×3.9 mm, 5 μ m, Waters公司);柱温35 ℃,流速0.5 mL/min;流动相A为0.3%甲酸水溶液,流动相B为0.3%甲酸乙腈溶液;梯度洗脱程序为:0 min, 20%A; 0～5 min, 20%A～50%A; 5～10 min, 50%A; 10～14 min, 50%A～20%A; 14～15 min, 20%A。

质谱条件:电喷雾电离(ESI)源,正离子方式检测,毛细管电压为3 kV,二级锥孔电压为3 V,透镜电压为0.2 V,去溶剂气流量500 L/h,锥孔气流量50 L/h,脱溶剂气为N₂,源温度为80 ℃,脱溶剂气温度为350 ℃，多反应监测(MRM)模式检测。

色谱柱的选择对于样品分离相当重要,不同的色谱柱对同一样品有不同的保留时间。由于喹诺酮类化合物的叔氨基和羧基官能团能在水中发生解离,普通色谱柱填料中残余的硅醇基和金属离子可通过氢键和离子交换作用对喹诺酮类化合物产生强烈的吸附,造成色谱峰拖尾、保留时间不稳定和分离度下降^{[ 10 ]}。在实验过程中我们使用不同的反相色谱柱对目标物进行分离,结果发现,Symmetry C₁₈色谱柱(150 mm×3.9 mm, 5 μ m)在上述的梯度洗脱程序下可以使四环素类化合物、喹诺酮类化合物、磺胺二甲嘧啶抗生素获得较好的分离,而且具有较好的重现性。由于Symmetry C₁₈色谱柱填料为高纯度的硅胶基质并经过端基处理,使标准物的峰形尖锐对称,因此能满足检测的要求。

将7种抗生素混合标准溶液以40 μ L/min 的针泵流速在正离子模式下进行母离子全扫描,确定四环素类化合物、喹诺酮类化合物和磺胺二甲嘧啶的分子离子,然后分别以各种抗生素的分子离子为母离子,对其子离子进行全扫描,得到7种抗生素的子离子。7种抗生素的二级质谱中主要的碎片离子峰是对应分子的脱水峰[M+H-H₂O]⁺,选取离子丰度较强,干扰较小的两个子离子分别作为定性离子和定量离子。实验重点优化了对灵敏度有较大影响的锥孔电压和碰撞能,各类抗生素的优化质谱条件见表1。

表 1 抗生素的质谱检测条件 Table 1 MS conditions for the determination of antibiotics Antibiotic Retention time/ min Quantitative and qualitative ion pairs (m/z) Collision voltage/ V Cone voltage/ V TC 3.82 445.3/410.3* 19 30 445.3/427.3 11 OTC 3.30 461.3/426.3* 19 28 461.3/443.4 12 CTC 6.09 479.3/444.3* 22 26 479.3/462.3 18 NOR 3.39 320.2/302.3* 20 30 320.2/276.3 17 CIP 3.48 332.3/231.3* 31 31 332.3/288.3 20 LOM 3.80 352.4/334.4* 18 33 352.4/308.4 15 SM2 6.57 279.3/186.1* 17 28 279.3/156.0 18 *Quantitative ion pair.

表 1 抗生素的质谱检测条件 Table 1 MS conditions for the determination of antibiotics

本文采用的固相萃取小柱为Waters公司的HLB系列小柱,实验以含20%(体积分数,下同)、10% 、6%的甲醇提取液过柱进行试验,发现提取液中甲醇含量过高时目标物不在SPE柱上保留,提取液中甲醇含量在10%以下时HLB的回收率较好,所以过柱时提取液中甲醇含量要低于10% ,这与李艳霞等的研究^{[ 4 ]}一致。样品流速在3～6 mL/min 时对抗生素的回收率影响不大,但样品流速超过6 mL/min 时回收率则有明显下降；考虑到萃取时间,控制样品流速为3～6 mL/min。

参考有关文献^{[ 11, 12, 13, 14, 15 ]},本文比较了不同提取液对猪粪和鸡粪中残留抗生素的提取效果。提取液包括乙腈、酸化乙腈、M1(McIlvaine-Na₂EDTA缓冲溶液(pH (4±0.05)))、M2(20%甲醇+80%M1)、M3(50%甲醇+50%M1)、M4(甲醇-乙酸-水(6 ∶ 3 ∶ 1,体积比)),这6种提取液对畜禽粪中四环素类化合物(10 μ g/g)、喹诺酮类化合物(10 μ g/g)和磺胺二甲嘧啶(1 μ g/g)的添加回收率试验结果表明:乙腈、酸化乙腈作为提取液时,稳定性不好,其余4种提取液对畜禽粪便中抗生素的提取效果如图1。

图1

Fig. 1

图 1 4种提取液对畜禽粪便中抗生素的提取效果 Fig. 1 Extraction efficiency of antibiotics with four extractants a. pig manure, b. chicken dung. M1: McIlvaine-Na2EDTA buffer; M2：20% methanol with 80% M1; M3：50% methanol with 50% M1; M4: mixture of methanol, acetic acid and water with volume ratio of 6 ∶ 3 ∶ 1.

结果表明,用甲醇-乙酸-水(6 ∶ 3 ∶ 1,体积比)溶液提取猪粪、鸡粪中的残留抗生素可达到较好的提取效果,其中除了CTC和LOM的回收率偏低外,绝大多数目标物的回收率在86%以上,提取效果好,因此本实验采用甲醇-乙酸-水(6 ∶ 3 ∶ 1,体积比)溶液作为提取液。

比较其余3种提取液,用McIlvaine-Na₂EDTA缓冲液提取畜禽粪尤其是鸡粪中的四环素类化合物可以得到较好的回收率;这是因为四环素类抗生素在弱酸性溶液中相对稳定,同时McIlvaine-Na₂EDTA缓冲溶液能够把与金属离子螯合的四环素类化合物提取出来^{[ 13 ]},但是喹诺酮类化合物的回收率较低。用甲醇-乙酸-水(6 ∶ 3 ∶ 1,体积比)溶液作为提取液,喹诺酮类化合物可达到较好效果；这可能是因为喹诺酮类化合物属酸碱两性化合物,其极性结构决定其可溶于有机溶剂的稀酸水溶液及冰醋酸。在McIlvaine-Na₂EDTA缓冲液中加入有机溶剂(20%甲醇)提取效果明显改善,可能是因为甲醇有利于将畜禽粪便中其他形态的抗生素提取出来,提取效果相对较好。进一步增加McIlvaine-Na₂EDTA缓冲液中甲醇的比例至50%时,回收率反而降低,这可能是因为甲醇含量较高使提取液中溶于水而不溶于甲醇的物质析出,发生醇沉现象,使大量的沉淀吸附、包裹部分有效成分^{[ 16 ]},而影响了提取效果。

配制5～1 000 μ g/L 的混合标准溶液,其中四环素类化合物及喹诺酮类化合物的质量浓度为50、100、200、400、600和 1 000 μ g/L,磺胺二甲嘧啶的质量浓度为5、10、20、40、60和100 μ g/L。以质量浓度为横坐标X,相应的峰面积为纵坐标Y,得到各种抗生素的标准曲线,结果表明在选定的浓度范围内标准曲线具有良好的线性(见表2),可以满足定量分析的需要。以3倍信噪比(S/N=3)确定仪器的检出限,以S/N=10确定仪器的定量限,结果见表2。

表 2 目标抗生素的检出限、定量限、线性方程及相关系数 Table 2 Limits of detection, limits of quantification and regression equations and correlation coefficients (r) of the antibiotics Antibiotic LOD/ ( μ g/L) LOQ/ ( μ g/L) Regression equation r TC 0.81 2.68 Y=0.024X+10.642 0.997 OTC 0.25 0.84 Y=0.056X+10.103 0.995 CTC 7.18 23.94 Y=0.077X+12.197 0.995 NOR 3.16 10.52 Y=0.082X+25.599 0.990 CIP 0.16 0.53 Y=0.045X+21.313 0.994 LOM 0.15 0.50 Y=0.021X+6.826 0.997 SM2 0.04 0.13 Y=0.015X+0.381 0.997 Linear range: 50- 1 000 μ g/L for TCs and QUs; 5-100 μ g/L for SM2. Y: peak area; X: mass concentration, μ g/L .

表 2 目标抗生素的检出限、定量限、线性方程及相关系数 Table 2 Limits of detection, limits of quantification and regression equations and correlation coefficients (r) of the antibiotics

在上述的优化条件下,得到7种抗生素混合标准溶液(四环素类化合物及喹诺酮类化合物质量浓度为 1 000 μ g/L、磺胺二甲嘧啶质量浓度为100 μ g/L)的MRM色谱图(见图2)。

图2

Fig. 2

图 2 7种抗生素混合标准溶液的多反应监测(MRM)色谱图 Fig. 2 MRM chromatograms of a mixed solution of the seven antibiotic standards

采用在空白猪粪和鸡粪样品中添加标准溶液的方法进行添加回收率测定。分别添加四环素类化合物、喹诺酮类抗生素低(1 μ g/g)、中(5 μ g/g)、高(10 μ g/g)3个含量水平,磺胺二甲嘧啶抗生素低(0.1 μ g/g)、中(0.5 μ g/g)、高(1 μ g/g)3个含量水平。涡旋混匀5 min,平衡12 h后,按所建立的方法进行样品处理及测定,每个含量水平重复6次,平均加标回收率和精密度见表3。

表 3 畜禽粪便中7种抗生素的加标回收率及相对标准偏差(n=6) Table 3 Recoveries and RSDs of the seven antibiotics in manure (n=6) Antibiotic Spiked/( μ g/g) Pig manure Chicken dung Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% TC 1 101 4.0 93 7.2 5 97 3.3 87 5.0 10 99 3.5 90 4.5 OTC 1 100 3.9 102 6.2 5 90 6.1 96 4.1 10 95 4.7 99 3.0 CTC 1 64 4.7 71 3.8 5 58 7.5 69 4.9 10 62 3.7 70 6.8 NOR 1 108 4.6 98 3.5 5 116 3.1 93 6.8 10 123 6.8 96 8.7 CIP 1 117 7.9 85 3.1 5 119 5.6 89 4.9 10 124 5.2 86 6.8 LOM 1 40 7.6 64 4.6 5 41 5.8 70 9.5 10 40 4.6 69 7.3 SM2 0.1 95 3.7 120 4.2 0.5 101 8.9 116 3.6 1 98 5.6 118 7.1

表 3 畜禽粪便中7种抗生素的加标回收率及相对标准偏差(n=6) Table 3 Recoveries and RSDs of the seven antibiotics in manure (n=6)

结果表明,四环素类、喹诺酮类抗生素在3个含量水平下,猪粪中的加标回收率分别为58% ～101% 、40% ～124% ,鸡粪中的加标回收率分别为69% ～102% 、64% ～98% ,磺胺二甲嘧啶抗生素在3个含量水平下,猪粪和鸡粪中的加标回收率分别为95% ～101%和116% ～120% 。相对标准偏差(RSD, n=6)均在3.0% ～9.5%之间。说明方法的准确度和精密度均符合分析的要求。

利用该方法测定了浙江省某城市郊区养殖场的17个样品(10个猪粪样品和7个鸡粪样品),每个样品做3个平行测定。在17个样品中均发现了四环素、土霉素和金霉素的存在,含量范围分别为1.12～7.61、0.52～1.34和0.72～66.62 mg/kg。其中有5个样品测到诺氟沙星、环丙沙星和洛美沙星,含量范围分别为1.07～2.71、0.86～2.04和0.35～0.47 mg/kg;有4个发现了磺胺二甲嘧啶,含量范围为0.02～0.03 mg/kg。