本文利用人血清白蛋白(HSA)水解的动力学体系构建具有代表性的数据集合。将HSA(购自Sigma-Aldrich公司)用超纯水(UP water)配成25 g/L 的工作液备用。配制酸性氯化钙溶液(浓度为0.005 mol/L,用盐酸调节pH为3),用于配制胰蛋白酶(trypsin)储存液。用酸性氯化钙溶液配制牛胰蛋白酶(购自Aladdin公司)为2 g/L 的储存液。将氯化钙溶于Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)中配成浓度为0.005 mol/L 的碱性氯化钙溶液(alkaline CaCl₂)。最后实验样品的组成见表1。在线取样用Agilent 1290 Infinity Autosampler来实现,动态水解样品采取每隔30 min取样一次。对中等反应速度样本(medium-digest-rate-sample)重复取样30次,对高反应速率样本(high-digest-rate-sample)和低反应速率样本(low-digest-rate-sample)各重复采样15次。

表 1 实验样品的配制与组成 Table 1 Composition of the samples Sample Composition Water-blank 1 mL UP water Alkaline-CaCl2-blank 1100 μ L UP water+100 μ L alkaline CaCl2 Neutral-HSA 1100 μ L UP water+100 μ L HSA Alkaline-trypsin 1100 μ L UP water+100 μ L alkaline CaCl2+50 μ L trypsin Medium-digest-rate-sample 1000 μ L UP water+100 μ L HSA+100 μ L alkaline CaCl2+15 μ L trypsin High-digest-rate-sample 1000 μ L UP water+100 μ L HSA+100 μ L alkaline CaCl2+50 μ L trypsin Low-digest-rate-sample 1000 μ L UP water+100 μ L HSA+100 μ L alkaline CaCl2+5 μ L trypsin UP： ultra-pure.

表 1 实验样品的配制与组成 Table 1 Composition of the samples

液相色谱-质谱数据由Agilent 1290 Infinity LC System串接Agilent 6460 Triple Quadrupole Mass Spectrometer采集。Jupiter C18色谱柱(Jupiter 5u C18 300A, 250 mm×2.00 mm,购自Phenomenex公司)。流动相A采用含有0.1%TFA (trifluoroacetic acid)的超纯水。流动相B采用含有0.1%TFA的乙腈。所有样品都在相同的流动相梯度条件(即:0～7 min, 15%B; 7～20 min, 15%B～95%B;流速为0.25 mL/min)下分离。数据处理在装有Windows Vista Business (64Bit)系统并且配置有24 GB内存的计算机上通过MATLAB软件实现。理论质谱图由mMass4.0软件包^{[ 22, 23 ]}模拟产生。

在上述动力学采样的数据中,本研究选择了15.80～15.98 min一段具有代表性的信号作为各个算法的测试基准。该段数据含有一个低丰度肽段(经识别,其序列为IAEVENDEMP),其响应约为实验中主要峰强度的1/100,并且淹没在基线波动当中,是典型的低丰度肽段信号(如图1所示)。该段数据是典型的干扰强、目标分析物响应低的双组分三维数阵。

图1

Fig. 1

图 1 评价算法所选取的数据区间 Fig. 1 Range of retention time selected to test the algorithms

三维数阵内含的三线性关系可以用公式(1)表达。其中,x_ijk是三维响应阵 X 在坐标(i, j, k)上的元素,即第k个样本在第i个m/z坐标、第j个保留时间测得的值;a_in是第n个组分在第i个m/z坐标上的质谱相对响应值;b_jn是第n个组分在第j个保留时间相对色谱图上的响应值;由于前两项是逐列归一化的,所以c_kn为第n个组分在第k个样本上的相对定量信息,它包含浓度等定量信息,与标准溶液的浓度成正比。x_ijk为N个组分响应的总和与残差e_ijk相加所得。

三线性分解算法的目标是将具有这样的三线性结构的数据最终分解为各个含有纯组分信息的矩阵(如图2所示)。根据算法的目标函数不同,有PARAFAC (parallel factor analysis)^{[ 24, 25, 26 ]}、ATLD (alternating trilinear decomposition)^{[ 14 ]}、SWATLD (self-weighted alternating trilinear decomposition)^{[ 27 ]}和APTLD(alternating penalty trilinear decomposition)^{[ 28 ]}等算法可用于这样的数据数学分离。这些系列算法的目标都是最大限度地拟合三维响应数阵,挖掘其中的定性、定量信息,因而具有很强的普适性,并且不需要人为设置一些条件参数。而对于双线性方法,本研究则选择了相关作者提供的MCR(multivariate curve resolution)工具箱进行计算。

图2

Fig. 2

图 2 三线性分解的示意图 Fig. 2 Diagram of trilinear decomposition The third-order tensor, which is constructed by the LC-MS data of K samples, can be decomposed into three component matrices ( A , B and C ), a super diagonal tensor I , and the corresponding residual tensor E directly. The matrix A (I×N) contains the normalized mass spectra of N components in the system; the matrix B (J×N) contains the normalized chromatographic profiles of N components in the system; the matrix C (K×N) contains the quantitative information of N components which are proportional to the concentration of the corresponding components.

对于MCR方法,尽管本研究尝试了所有可能的参数设置,依然无法将目标肽段的低丰度信号与背景进行有效的分离。也就是说,对于低丰度肽段的分析,双线性方法几乎不适用。前面提及的多种三线性分解算法的应用结果,其色谱图( B 矩阵)和定量信息( C 矩阵)的直观结果是可以接受的,将背景干扰和目标肽段的信号分开了。但质谱图的质量却与客观实际不相符合(见图3),在肽段的质谱信号本来为0的地方出现了明显的负值,并且显示出与色谱背景信号负相关的关系。这些经典的算法在寻求对三维数阵最佳拟合的同时,的确没有考虑到质谱数据的稀疏特性。因而这样获得的结果显然有些不符合实际。

图3

Fig. 3

图 3 常规三线性方法分解结果中表现出来的对质谱数据特性的不适应性(以ATLD结果为例) Fig. 3 Inadaptability of trilinear decomposition algorithm using the results of ATLD as an example (The resolved components contained obviously negative values)

要提高质谱的三线性分解质量,必须要在原来的三线性分解算法基础上引入一些自动的约束条件,在提高结果质量的同时减少人为操作,以便于高通量的数据处理。而与质谱图的稀疏特性相对应的数学约束为“非负约束”,引入非负约束应该能改善算法的结果质量。对于PARAFAC算法,在较早前已经有研究者提出了各种非负求解的方案。Bro等^{[ 29 ]}曾提出展开方式求解,但是由于LC-MS数据是非常庞大的,采用展开成矩阵或者向量求解的策略,即使使用64位的操作系统,依然会耗尽软件的内存地址编码数目。Paatero^{[ 30 ]}则提出了通过引入惩罚项的方案来实现非负计算,然而惩罚项部分需要非常复杂的计算,不但衍生了更多的临时变量,还附带了很多对三维阵的计算操作,因而该方案的计算时间消耗非常大。可见,基于PARAFAC算法的改进会产生对计算资源和时间的严重消耗,这样的算法不适宜推广。根据ATLD算法的计算策略具有计算资源节约和收敛快的特点,本文从ATLD衍生出了新颖的带有非负约束的算法NNATLD(non-negative alternating trilinear decomposition)。新算法交替优化求解公式(2)中的目标函数,从而最终获得良好的数学分辨结果。新的算法不但使用切片矩阵的方案,还对矩阵进行了有效的压缩,所以非常节约计算资源,同时具有非常快的收敛速度。新算法对于本组测试数据会在10次迭代内收敛到最终结果,比以往的算法都要快。新算法能自动给出组分数估计的建议,用户只要给出比实际组分数多的估计,算法就能自动寻找合理的组分数。

在计算结果方面,新算法能获得非常好的色谱和定量结果,且质谱图的质量能较好地符合定性的客观要求(见图4)。新算法不但满足了质谱图的稀疏性特性,同时也符合肽段质谱图的结果并与理论的肽段质谱图吻合较好。在低丰度肽段的信号保留方面,新算法保留了m/z 1168.5 的[M+Na]^＋准分子离子峰。该峰的强度不到主峰(m/z 573.9)强度的1% 。由此可以得出结论,新算法能较好地适应高丰度与低丰度信号强度相差超过1万倍的情况分析。

图4

Fig. 4

图 4 NNATLD的三线性分解结果 Fig. 4 Results of NNATLD for the test data The trilinear decomposition results contain the information of normalized mass spectra, chromatographic profiles and quantitative information. The graphics at the bottom are the fitting results between the spectrum resolute by NNATLD (deep blue) and the spectrum simulated by mMass software.

三线性分解策略与MRM方法的不同之处:只需要采集一级质谱谱图并能做到采集全部离子信号,免除了在二级质谱确定定量和定性离子的麻烦,减少了二级质谱对离子信号强度的降低效应;由于自身能够按照物理/化学意义分离信号及其定量信息,所以并不要进行离子选择;并且三线性分解算法要求的只是目标分析物能在质谱仪上有自身的信号,并不要求各个仪器上面的谱图完全一样,因而基于三线性分解算法建立蛋白质定量策略是可以跨离子源/跨仪器使用的,该定量策略具有较好的通用性。