毛细管电色谱仪(K1060高效毛细管电泳仪);熔融石英毛细管(内径75 μ m,河北永年锐沣色谱器件有限公司);核糖核酸酶B(RNase B)、转铁蛋白(TRF)、牛血清白蛋白(BSA)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)均购自美国Sigma公司;超纯水均为Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司)制备。

用注射器向石英毛细管中注入水润洗内壁。氮气吹干后依次用0.1 mol/L 盐酸、去离子水、0.1 mol/L 氢氧化钠、甲醇冲洗毛细管。最后用去离子水冲洗,至流出液pH 7.0左右。氮气吹干后用硅胶塞封闭毛细管柱两端,4 ℃下保存备用。

采用柱外合成引发剂的方法,ATRP引发剂为实验室自制的3-(2-溴异丁酰胺基)丙基三乙氧基硅烷(BIBAPTES)^{[ 16 ]}。用乙醇配成质量浓度为 7.4054 g/L 的溶液并注入石英毛细管中反应过夜。

将0.01 mmol的氯化亚铜、0.015 mmol的1,4,7,7-五甲基二乙烯基三胺、2 mmol的GMA单体和700 μ L的环己醇涡旋混溶,并通入高纯氮气除去反应体系中的氧,然后用注射器注入上述引发剂处理后的毛细管中,室温下聚合反应1 h。

用高压恒流泵向聚合反应后的毛细管中依次通入甲醇、水各冲洗4 h,以除去柱内未反应的单体和其他杂质,然后用氮气吹干。接着注入0.2 mol/L H₂SO₄，于80 ℃水浴中反应3 h,用水冲洗柱至中性。注入新鲜配制的0.1 mol/L 的NaIO₄溶液于室温下密封反应1 h,用水、甲醇依次冲洗柱各5次。配制50 g/L 的氨基葡萄糖甲醇溶液,加入10 mmol/L 氰基硼氢化钠,混合后注入上述毛细管中室温放置过夜。切去毛细管两端至所需长度,密闭备用。

样品测试前,在15 kV电压下用缓冲溶液平衡仪器30 min,至基线稳定后开始测定。流动相在使用前经0.45 μ m滤膜过滤及超声振荡除气。

葡萄糖聚合物修饰开管柱毛细管柱的制备路线如图1所示。为在毛细管柱内壁引发葡萄糖聚合物生长,使用一端为可与石英毛细管柱内壁硅羟基反应的烷氧基,另一端为可引发ATRP反应的溴代烷的双官能团引发剂,以GMA为聚合反应单体,在毛细管柱内壁原位引发ATRP生成GMA聚合物链。之后将GMA聚合物侧链末端的环氧基团转化为醛基,通过醛基与氨基葡萄糖上氨基的缩合反应将葡萄糖引入GMA聚合物侧链,从而在毛细管柱内壁生成含有大量多羟基葡萄糖聚合物(PGMA-N-glucose)的亲水固定相。

图1

Fig. 1

图 1 SI-ATRP方法制备PGMA-N-glucose修饰的开管柱路线示意图 Fig. 1 Schematic overview of the preparation of PGMA-N-glucose modified OTCC by SI-ATRP SI-ATRP: surface initiated atom transfer radical polymerization.

考察了毛细管柱内不同的聚合反应时间与柱后压的关系。毛细管柱内聚合反应时间不同,内壁修饰的聚合物固定相厚度就会不同,对色谱分离性能影响很大。聚合时间过长会导致柱后压太高,无法进行电色谱分离,甚至会堵塞毛细管。因此在相同流速下,以甲醇为流动相考察了不同的聚合反应时间制备的开管毛细管柱在高压恒流泵上的柱后压。从图2可知,聚合时间较短时毛细管内壁修饰的聚合物少,柱后压较低,聚合30 min时柱后压为896 kPa;随着聚合时间增长,柱后压增大,聚合60 min时柱后压为 3855 kPa,当聚合时间达到90 min时柱后压达到 12617 kPa,直接导致柱接口处漏液;继续延长反应时间,最终会堵塞毛细管。

图2

Fig. 2

图 2 PGMA-N-glucose修饰开管毛细管柱的柱后压随聚合时间的变化 Fig. 2 Effect of the polymerization time on the backpressure of the PGMA-N-glucose modified open tubular column

在上述实验的基础上选择了未修饰的毛细管空柱以及聚合30 min、60 min的开管毛细管柱用于4种核苷类小分子分离。核苷类化合物一般被用来评价亲水性色谱柱的性能^{[ 17 ]}。从图3可以看出,腺苷和鸟苷在空柱上分离效果最差;而在聚合30 min的柱上也没有完全分离;在聚合60 min的柱上分离效果最好。因此选择聚合时间为60 min的毛细管开管柱用于后续的分离应用。

图3

Fig. 3

图 3 不同聚合时间制备的开管毛细管柱分离4种核苷类物质的电色谱图 Fig. 3 CEC chromatograms of the separation of four nucleosides by PGMA-N-glucose modified OTCC prepared with different polymerization time Experimental conditions: column, 200 mm×75 μ m; mobile phases, 50 mmol/L borax and sodium hydroxide buffer (pH 10); applied voltage, 15 kV; detection wavelength, 254 nm. Peaks: 1. thymine; 2. adenosine; 3. vernine; 4. 5-bromouracil.

从图4可以明显看出,经SI-ATRP处理后毛细管柱内壁生长出聚合物层,其厚度随聚合时间延长而增加。当聚合时间达120 min,开管柱就被聚合物完全填充,造成柱压过大;而聚合时间为30 min时,毛细管内壁修饰物太少,电渗作用明显,也不利于样品的保留;当聚合时间为60 min,毛细管柱内壁明显修饰上具有波浪状结构的聚合物层,柱后压适中,验证了上述柱后压及分离性能实验的结果。

图4

Fig. 4

图 4 不同聚合时间制备的PGMA-N-glucose修饰开管毛细管柱横截面的SEM照片 Fig. 4 Cross-sectional SEM images of PGMA-N-glucose modified OTCC prepared with different polymerization times Polymerization times: a. 30 min; b. 60 min; c. 120 min.

采用PGMA-N-glucose修饰的开管毛细管柱对6种小分子(苯丙氨酸、胸腺嘧啶、腺苷、鸟苷、5-溴尿嘧啶和水杨酸)进行电色谱分离。如图7所示，分离取得了很好的效果。而且化合物的出峰顺序与其极性相关:极性越小出峰越早,极性越大出峰越晚。

图7

Fig. 7

图 7 小分子混合物在PGMA-N-glucose修饰开管毛细管柱上分离的电色谱图 Fig. 7 CEC chromatogram of a mixture of the small molecular compounds separated on PGMA-N-glucose modified OTCC Experimental conditions: column, 200 mm×75 μ m; mobile phase, 50 mmol/L borax and sodium hydroxide buffer (pH 10); applied voltage, 15 kV; detection wavelength, 254 nm. Peaks: 1. phenylalanine; 2. thymine; 3. adenosine; 4. vernine; 5. 5-bromouracil; 6. salicylic acid.

采用PGMA-N-glucose修饰的开管毛细管柱对3种蛋白质(RNaseB、TRF和BSA)进行电色谱分离,结果如图8所示。含糖聚合物结构有效地降低了影响蛋白质分离的硅羟基效应,电渗流低,有利于改善生物大分子的分离效果,并明显抑制其在管壁上的非特异性吸附，对3种蛋白质实现了良好分离,5次连续进样分析，3种蛋白质保留时间的RSD为2.3% 。说明PGMA-N-glucose修饰的开管毛细管柱对蛋白质大分子的分离具有很好的稳定性和重复性。而未修饰毛细管柱的表面硅羟基影响大,电渗作用明显,导致蛋白质样品的保留时间过长影响分离效果,而且存在明显的非特异性吸附,样品损失较大,不利于微量样品的分离分析。

图8

Fig. 8

图 8 3种蛋白质在(a)未经修饰的毛细管柱和(b)PGMA-N-glucose修饰的开管毛细管柱上分离的电色谱图 Fig. 8 CEC chromatograms of three proteins separated on (a) bare capillary and (b) PGMA-N-glucose modified OTCC Experimental conditions: column, 200 mm×75 μ m; mobile phase, 20 mmol/L sodium carbonate and sodium bicarbonate buffer (pH 11); applied voltage, 15 kV; detection wavelength, 214 nm. Peaks: 1. RNaseB; 2. BSA; 3. TRF.