色谱  2013, Vol. 31 Issue (6): 522-530   PDF (649KB)    
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李楠楠
周廉淇
毛心丽
张姣
卫军营
林虹君
李佳斌
田芳
张养军
钱小红
18O同位素标记定量肽段串联体蛋白质结合同位素稀释-多反应监测质谱的蛋白质绝对定量新方法
李楠楠1,2, 周廉淇2, 毛心丽2, 张姣2, 卫军营2, 林虹君2, 李佳斌2, 田芳2, 张养军2 , 钱小红2    
1. 广西医科大学, 广西 南宁 530021;
2. 蛋白质组学国家重点实验室, 北京蛋白质组研究中心, 军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 北京 102206
收稿日期：2013-03-31
基金项目：国家重大科学计划项目(2012CB910603,2010CB912704);国家重大科学仪器设备开发专项项目(2011YQ030139,2011YQ06008408,2011YQ09000504,2012YQ12004407);国家高技术研究发展计划(2012AA020202);国家自然科学基金重点项目(20735005,21275159,31100591).
通讯作者：张养军.E-mail:zhangyangjun6314@yahoo.com.cn.
摘要：建立了定量肽段串联体蛋白质(concatamers of Q peptides, QconCATs)结合18O同位素标记-多反应监测质谱的蛋白质绝对定量新方法。首先对QconCAT重组蛋白质进行了纯度表征,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表征结果表明重组蛋白质的纯度在99%以上,相对分子质量约为63.4 kDa。对QconCAT重组蛋白质酶切后的肽段混合物进行质谱分析,并经pFind和pLabel软件处理,验证了目标肽段。还考察了QconCAT重组蛋白质的酶切效率和18O标记效率,并对QconCAT蛋白质结合18O标记-同位素稀释-多反应监测质谱方法进行了评价。实验结果表明,采用该方法对腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis, TTE)中选定蛋白质的肽段进行绝对含量测定时,相对标准偏差小于20%,准确度较高,说明该方法可用于复杂生物样本中蛋白质的绝对定量。更重要的是所建方法不仅解决了细胞培养氨基酸稳定同位素标记(SILAC)技术的重标试剂价格昂贵的问题,也为定量蛋白质组学提供了一种新的方法。
关键词： 定量肽段串联体蛋白质     同位素稀释     多反应监测质谱     18O标记     蛋白质组学    
A novel method for absolute protein quantification using 18O isotope labeled concatamers of Q peptides combined with isotope dilution-multiple reaction monitoring mass spectrometry
LI Nannan1,2, ZHOU Lianqi2, MAO Xinli2, ZHANG Jiao2, WEI Junying2, LIN Hongjun2, LI Jiabin2, TIAN Fang2, ZHANG Yangjun2 , QIAN Xiaohong2    
1. Guangxi Medical University, Nanning 530021, China;
2. State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 102206, China
Received: 2013-03-31
Abstract: A method of concatamers of Q peptides (QconCATs) protein labeled with 18O-multiple reaction monitoring mass spectrometry for absolute quantification of proteins is established. The purity of the QconCAT recombinant protein was characterized by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and its purity was above 99%. The relative molecular mass was approximately 63.4 kDa. The peptides digested from the QconCAT recombinant protein and the extract of Thermoanaerobacter tengcongensis (TTE) were analyzed by mass spectrometry. The raw data were processed by pFind and pLabel softwares. The results showed that the efficiencies of protein digestion and the 18O labeling efficiency were able to meet the need of the protein quantification. The performance of the method was evaluated. The absolute contents of the selected proteins in TTE were determined with the relative standard deviations of less than 20% and the accuracy is high. The method not only avoid using the expensive reagent of stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC), but also provides an alternative way for the accurately absolute quantification of proteins in biological samples for quantitative proteomic research.
Key words: concatamers of Q peptides (QconCATs)     isotope dilution     multiple reaction monitoring mass spectrometry     18O labeling     proteomics    

蛋白质组学定量方法主要包括相对定量和绝对定量两种。相对定量方法主要是通过对不同生理状态的蛋白质组进行比较，发现差异蛋白质组的一种方法;而绝对定量方法是测定细胞、组织或体液中每种蛋白质的绝对含量或浓度的一种方法。其中差异蛋白质组的高通量绝对定量是其验证和进一步转化的关键步骤。

目前,复杂生物样本中蛋白质绝对定量的方法主要有基于内标法的多反应监测质谱方法和基于质谱数据统计分析的非标记方法[ 1 ]。对基于内标的多反应监测质谱绝对定量方法而言,内标肽段的制备是该方法非常重要的前提条件。通常内标肽段的制备主要分为化学合成和生物合成两种途径。化学合成肽段的缺点是成本高;需要定量每条内标肽段,检测的操作步骤比较繁琐;通量低。而采用生物技术合成内标肽段定量肽段串联体蛋白质(QconCATs)技术可高通量的制备内标肽。QconCATs是由化学或内源性蛋白质酶切产生的、用于一些目标蛋白质定量的标签肽段构成的连体蛋白质[ 2, 3, 4, 5 ],即通过人工设计、表达和使用重组技术制备的蛋白质。其步骤为,首先通过预测软件筛选出目标蛋白质中的标签肽段(唯一肽段,即用于目标蛋白质定量的肽段),然后进行拼接,并翻译成相应的核苷酸序列,再根据大肠杆菌密码子偏好特性对其进行优化,确定最终的核苷酸序列,进行该核苷酸序列的合成,并通过BamH I和Xho I 酶将合成的核苷酸插入到原核表达载体pGEX-4T-2的质粒中,构建可以表达QconCAT的质粒[ 6 ];然后,对合成的质粒进行DNA测序,确证构建质粒中核苷酸序列;最后,通过大肠杆菌表达系统对构建的质粒进行重组融合蛋白质的表达和纯化。纯化后的QconCAT蛋白质需要进行表征,一般有两种方法。一是在蛋白质水平上进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),二是在肽段水平上进行质谱表征。一般在制备QconCAT蛋白质时,需要将细胞传递三代以上,以获得含90%的重标氨基酸的重组蛋白质。通过该方法制备内标肽的优点是在细胞培养过程中实现了对标签肽段的标记,且标记效率高。但该方法也存在缺点,即重标同位素表达的蛋白质的量很低,而且重标氨基酸和培养基质昂贵[ 7, 8 ]。而采用传统的大肠杆菌表达系统可获得高表达量的QconCAT蛋白质,但不能作为内标,需要标记。同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ)是近年来开发的一种新的蛋白质标记定量技术,优点是可以同时标记8个样品,一次实验实现对8个样品中蛋白质的鉴定和定量,且标记速度快,标记效率高。但该方法的缺点是试剂盒价钱昂贵,浓缩等前处理过程非常复杂。

针对以上问题,本文采用了以酶促18O同位素标记轻标表达的QconCAT蛋白质作为内标,结合同位素稀释-多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)质谱技术进行蛋白质的绝对定量[ 9, 10 ]。优点是18O试剂价格比细胞培养氨基酸稳定同位素标记(SILAC)和iTRAQ试剂低廉,且这种方法适合高通量的蛋白质定量,MRM技术的高特异性、高灵敏度和高重现性的特点适合复杂生物样本中蛋白质的定量[ 11, 12, 13, 14 ]。该方法将会在目标蛋白质组的定量验证和确认中发挥重要作用。



1 实验部分
1.1 仪器与试剂

TSQ vantage质谱系统(Thermo Scientific); Eksigent nanoLC\52D高效液相色谱仪(AB SCIEX); 4800 Proteomics Analyzer基质辅助激光解吸电离-飞行时间串联质谱仪(MALDI-TOF/TOF MS, AB SCIEX);毛细管高效液相色谱-电喷雾-线性离子阱-傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(HPLC-ESI-LTQ-FT MS, Thermo Fisher Scientific);超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司); Zip Tip脱盐柱(美国Promega公司); Thermo Orion MODEL 818型pH计(Thermo Scientific)。

QconCAT质粒构建(生工生物工程(上海)有限公司); DNA测序(华大基因);大肠杆菌感受态细胞DH5 α 和异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG, TaKaRa公司); 1 mol/L Tris/HCl (pH 8.0, United States Biochemical);磷酸缓冲液(PBS, pH 7.4, Life Technologies);酵母提取物(OXOID公司);谷胱甘肽琼脂糖填料(美国GE公司);还原型谷胱甘肽(北京欣经科生物技术有限公司);质粒提取试剂盒和氨苄青霉素(生工生物工程(上海)有限公司); α -氰基4-羟基肉桂酸(CHCA, Sigma);测序级胰蛋白酶(Promega公司); 97%的H218O(上海化工研究所); RapigestTM SF(美国Waters公司);乙腈(色谱纯,Sigma-Aldrich);超纯水,经Millipore纯水系统纯化,电阻率达到18.2 M Ω \5cm;腾冲嗜热菌(TTE)由华大基因研究中心提供。其他试剂为国产分析纯。

1.2 实验方法
1.2.1 内标肽段的选择

依据前期构建的腾冲嗜热菌蛋白质组表达谱数据库,随机选择16种蛋白质,对其进行定量。蛋白质的标签肽段选择原则包括:(1)不包含漏切位点(missed cleavage, MC); (2)必须是该蛋白质匹配的唯一性肽段;(3)肽段长度为8～24个氨基酸;(4)不含容易发生可变修饰(如蛋氨酸的氧化等)的氨基酸;(5)从QconCAT重组蛋白质的表达水平考虑,构建的蛋白质的相对分子质量最好在60～91 kDa,以便于其在大肠杆菌中的表达;(6)肽段的溶解性好;(7)肽段在质谱中响应强。基于以上原则,在如表1所列的16种随机选择的蛋白质中,选择出31条肽段。

表 1 从随机选择的TTE的16种蛋白质中选择的31条肽段 Table 1 31 peptides randomly chosen from 16 proteins of TTE
1.2.2 构建QconCAT质粒

由生工生物工程(上海)有限公司将选定的31条肽段翻译成相应的DNA序列,进行化学合成,在原核表达载体pGEX-4T-2上构建质粒,即pGEX-4T-2-hotI,并由华大基因通过DNA测序,对质粒进行确认。

1.2.3 QconCAT的表达和纯化

取100 μ L感受态细胞BL21(DE3)于冰浴上融化,静置约30 min。加入1 μ L(＜50 ng)质粒,轻轻吹打混匀,冰浴30 min。将菌液放入42 ℃水浴中热激90 s,立即放入冰浴中2 min;加入0.4 mL LB培养液(胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化钠10 g/L),于37 ℃恒温摇床上温育(150 r/min, 1 h)。将菌液以 4000 r/min 离心3 min,移去200 μ L上清液后用加液枪将菌体重悬,均匀涂布于含氨苄抗性的琼脂平板表面,平板于37 ℃静置1 h后倒置培养过夜。

QconCAT的诱导表达。挑取转化有质粒的单菌落,接种于10 mL选择性LB液体培养基中,在37 ℃下以180 r/min 振摇培养过夜。次日将培养过夜 的菌液50 μ L再接种于5 mL选择性LB液体培养基中。在37 ℃下以200 r/min 振摇培养至光密度OD600=0.6～0.8时(约2.5 h),取1 mL样本作为诱导前标本,10000 g离心1 min收集菌体沉淀,-20 ℃冻存备用。加入0.5 mol/L IPTG于菌液中,使IPTG终浓度为0.5 mmol/mL,在37 ℃下以200 r/min 振摇培养2～5 h。取1 mL样本作为诱导后标本,同上法收集菌体沉淀,-20 ℃冻存备用。将诱导前后菌体沉淀用20～40 μ L PBS(pH 8.0)重悬,加入等体积的2×SDS上样缓冲液,煮沸加热5 min, SDS-PAGE分离,考马斯亮蓝染色3 h后,脱色观察结果。选取诱导成功的细菌克隆,扩大诱导规模,收集菌体沉淀,于-20 ℃保存,准备做下一步分析及纯化。

菌体的裂解:取25 mL菌体,加800 μ L的PBS重悬,加16 μ L的蛋白酶抑制剂后,进行超声破碎,超声(超声1 s停1 s,功率＜ 400 W,累计90个循环)直至液体澄清。取10 μ L裂解液进行SDS-PAGE分析。

融合蛋白质的纯化:移取80 μ L摇匀的填料于离心管中,500 g离心5 min,去除上清液。然后加入PBS缓冲液(pH 7.3) 500 μ L平衡填料,500 g离心5 min,去除上清液;重复一次。将菌体裂解液加入填料中,于4 ℃孵育1 h,用混旋仪混匀。于4 ℃下500 g离心5 min,弃去上清液,留10 μ L进行SDS-PAGE分析。其余部分加入500 μ L PBS (pH 7.3), 500 g离心5 min,弃去上清液。然后加一半填料体积的洗脱液(elution buffer, 50 mmol/L Tris/HCl-10 mmol/L还原型谷胱甘肽),室温混匀10 min, 500 g离心5 min,取上清液保留;重复一次,取上清液合并,-80 ℃保存。取菌体裂解液、流穿液和洗脱液各10 μ L,分别加2×上样缓冲液(主要成分:溴酚蓝和甘油)10 μ L,煮沸3 min,用掌式离心机快速离心后,采用10%预制胶进行SDS-PAGE分析。电泳条件为80 V,20 min;120 V,1 h。

此外,还对上述2个克隆表达成功的QconCAT重组蛋白质分别进行纯化,然后进行胰蛋白酶酶切,最后采用质谱进行表征。

MALDI-TOF/TOF MS分析条件:待测样品与基质( α -氰基-4-羟基肉桂酸)混合后点靶。马心肌红蛋白胰酶酶切肽段作为标准物对仪器进行外标校正,选择校准范围≤0.1 Da,误差≤10×10-6。一级质谱数据采集使用MS-1 kV反射模式,加速电压20 kV,每张谱图累加 1500 次。仪器控制软件为 4000 series software,数据处理软件为GPS ExplorerTM software 2.0。线性模式扫描范围m/z 10000～100000,激光能量 4500;反射模式扫描范围m/z 2000～10000 时,激光能量 4200。

HPLC-ESI-LTQ-FT MS分析条件:高效液相色谱Agilent 1100系统,自动进样器上样,体积20 μ L。毛细管液相色谱条件为流动相A: 0.1%(如无特殊说明均为体积分数)甲酸-2%乙腈;B相:0.1%甲酸-80%乙腈;流速300 nL/min。洗脱梯度:0～90 min, 6%B～40%B; 90～100 min, 40%B～100%B; 100～110 min, 100%B; 110～120 min, 100%A平衡色谱柱。扫描范围m/z 375.0～1500.0,采集时间110 min。采用数据依赖正离子模式,在全扫描中选择10个信号最强的离子进行串联质谱分析,重复2次后动态排除,碰撞能量35% ,时间10 ms。质谱数据以raw文件保存,采用pFind 2.6软件(中国科学院计算技术研究所,北京)分析数据并进行检索。其参数设置为母离子质量偏差(precursor tolerance)10×10-6;碎片离子质量偏差(fragment tolerance)0.6 Da;数据库QconCAT_31. Trypsin_KR-C;蛋白质酶解类型为胰蛋白酶酶解;最多允许2个漏切位点;可变修饰为蛋氨酸氧化修饰(Oxidation_M_15.995 Da);肽段序列氨基酸固定修饰为半胱氨酸的烷基化修饰(Carbamidomethyl_C_57.021 Da)。检索假阳性率(FDR)≤1% 。同时采用pLabel 2.4软件分析二级碎片离子,碎片离子质量偏差为0.5 Da。

1.2.4 内标肽段的制备

移取QconCAT重组蛋白质各20 μ g,分别加入30 μ L 50 mmol/L NH4HCO3混匀后95 ℃变性10 min。因其不含二硫键结构,所以不需要进行还原和烷基化处理。变性后先加入质量为底物1%的胰蛋白酶,酶切2 h后再加同样量的胰蛋白酶,酶切过夜。取适量的酶切液进行MALDI-TOF MS和HPLC-ESI-LTQ-FT MS分析鉴定。

将酶切产生的肽段溶液冷冻干燥后加入H218O重溶,并加入质量为底物1%的胰蛋白酶(H218O溶解)和最终质量浓度为1 g/L的RapigestTM SF。微波中反应5 min,冷却至室温,循环共计30 min。标记反应完成后,加入H218O溶解的二硫苏糖醇(DTT)至10 mmol/L, 100 ℃水浴微波加热10 min,最后加入H218O溶解的碘乙酰胺(IAA)至50 mmol/L,避光反应1 h[ 15 ]。用Zip Tip柱脱盐后将反应产物冻干,用2%乙腈-0.1%甲酸重溶,15000 g高速离心10 min,进行TSQ vantage检测和定量,平行3次,上样量约为120 fmol。

1.2.5 腾冲嗜热菌全蛋白的提取与酶切

根据文献[ 16 ],采用Bradford法测定腾冲嗜热菌的蛋白质质量浓度为12.5 μ g/ μ L。将蛋白质分装后于-80 ℃保存备用。

取两份分装好的8 μ L腾冲嗜热菌蛋白质溶液(各含100 μ g蛋白质)。先分别加入40 μ L 50 mmol/L的NH4HCO3,混匀后加入DTT至10 mmol/L, 37 ℃水浴4 h。再加入IAA至50 mmol/L避光反应1 h。加入质量为底物1%的胰蛋白酶酶切2 h,再加同样量酶过夜。将腾冲嗜热菌酶切产物分装后于-80 ℃保存备用。

2 结果与讨论
2.1 QconCAT重组蛋白质的纯度表征

首先对纯化的QconCAT蛋白质进行SDS-PAGE纯度表征,结果如图1所示。

图 1 大肠杆菌裂解液、流穿液和洗脱液的SDS-PAGE电泳图 Fig. 1 SDS-PAGE image of the lysate, flowthrough and elution fractions of E. coli L-1: E. coli lysate fraction 1; L-2: E. coli lysate fraction 2; L-3: E. coli lysate fraction 3. FT-1: flowthrough fraction 1; FT-2: flowthrough fraction 2; FT-3: flowthrough fraction 3. EF-1: elution fraction 1; EF-2: elution fraction 2; EF-3: the elution fractions from the negative clone.

在pGEX-4T-2-hotI质粒的3个单克隆表达的QconCAT重组蛋白质(63.4 kDa,由31条肽段和GST(glutathione S-transferase)标签蛋白质(26 kDa)构成)的SDS-PAGE电泳图中,标注部分为纯化的目标蛋白质,且纯度较高。Bradford法测定纯化液1、纯化液2分别含蛋白质0.41、0.56 μ g/ μ L。单克隆3没有诱导并表达成功,原因可能是单克隆3是阴性克隆。本次实验重复了2次,结果一致。

2.2 QconCAT重组蛋白质酶切效率

完全酶切是准确定量的前提。因此对两份QconCAT重组蛋白质的酶切效率进行了考察。图2a和b表明,酶切18 h后虽然在蛋白质水平上已经把蛋白质切完全了,但是在肽段水平上还是有1到2个漏切位点;图2c和d表明,延长酶切时间4 h虽然使含有2个漏切位点的肽段消失了,但还是有含1个漏切位点的肽段存在,图中圆圈标记部分即是。为了验证是哪两条肽段连在一起,我们把该酶切液进行了HPLC-ESI-LTQ-FT MS分析。

图 2 QconCAT重组蛋白质延长酶切时间(a, b)前和(c, d)后的MALDI-TOF MS谱图 Fig. 2 TMALDI-TOF MS spectra of the QconCAT protein digested (a, b) before and (c, d) after extending time

QconCAT蛋白质酶切液进行HPLC-ESI-LTQ-FT MS分析,如图3所示的是其中一条肽段(AFAAGVDLGR)的串联质谱图。从图3可以看出该肽段的m/z 976.52,与理论质荷比一致。另外,b、y离子的匹配程度高,说明这条肽段得到了可靠的鉴定。最终的质谱分析结果表明,在31条肽段中有24条肽段可以作为内标肽段。其余的肽段中,有1条肽段与其连接的GST蛋白质末端缺少胰蛋白酶酶切位点K或R,另外6条因可能含有漏切位点而不能作为内标。存在漏切位点的肽段列于表2。

图 3 肽段AFAAGVDLGR的串联质谱图 Fig. 3 The tandem mass spectrum of AFAAGVDLGR
表 2 含漏切位点的肽段序列、理论质荷比、漏切后的质荷比、GI编号及偏差 Table 2 Peptide sequences with the missed cleavage sites, the theoretical m/z, the identified peptides containing missed cleavage (m/z), GI numbers and deviations

由表2得出,3号、4号肽段连在一起,12号、13号肽段连在一起,15号、16号肽段连在一起。总结发现这些肽段大多具有共性。K和R的羧基端或者氨基端如果与L相邻,或者K、R与A相邻,大多会出现漏切现象。含有漏切位点的肽段可能造成较大的定量误差,不能作为内标。在合成QconCAT重组蛋白质或者其他重组蛋白质用于蛋白质组学定量时应考虑这些因素。

2.3 腾冲嗜热菌全蛋白酶切效率

对腾冲嗜热菌提取的蛋白质混合物按QconCAT重组蛋白质同样条件进行了酶切。图4是酶切18 h后的线性模式质谱图。其中图4a为蛋白质水平上的质谱图,可判断酶切完全的程度;图4b为肽段水平上的质谱图,圆圈标注的为大肽段分子,说明在质谱中可能存在漏切位点。图4c是延长酶切时间4 h后的线性模式质谱图,m/z 2981.0 ～ 10168.0 之间无大肽段分子存在,说明酶切完全,可以进行下一步定量实验。

图 4 腾冲嗜热菌全蛋白质延长酶切时间(a, b)前和(c)后的MALDI-TOF MS谱图 Fig. 4 TMALDI-TOF MS spectra of the proteins of TTE digested (a, b) before and (c) after extending time
2.4 内标肽段18O标记效率

为了获得准确的定量结果,对QconCAT重组蛋白质酶切后18O标记效率进行了考察。在18O标记过程中发现,有的肽段很容易被标记上,有的肽段则不容易被标记上或者即使标记上效率也不高,因此不能用于定量。重点考察了24条肽段,其中80%的肽段标记效率都达到了90%以上,图5是其中3条肽段标记前后的MALDI-TOF MS谱图。

图 5 QconCAT重组蛋白质酶切肽段18O标记(a, c, e)前和(b, d, f)后的MALDI-TOF MS谱图 Fig. 5 TMALDI-TOF MS spectra of the peptides digested from the QconCAT protein (a, c, e) before and (b, d, f) after labeled with 18O a, b. AFAAGVDLGR; c, d. AGYTAIVSHR; e, f. VDDGNDLDAIR.
2.5 内标肽段绝对含量的测定
2.5.1 标准曲线的制作

由于QconCAT重组蛋白质的肽段设计时整条肽段的前端加了GST标签,所以QconCAT重组蛋白质的含量需要通过GST标签蛋白质中的标签肽段进行测定。

分别准确配制标签肽段GST-1和GST-2系列浓度:10、20、40、80、160、320、640、1280 fmol/ μ L。各取1 μ L相同浓度的标签肽段溶液混合,并加入QconCAT重组蛋白质酶切液20 fmol/ μ L 5 μ L,配制成系列的工作溶液,进行液相色谱-TSQ vantage质谱分析。以18O标记的QconCAT肽段与GST-1、GST-2的质谱峰面积比为纵坐标,以18O标记的QconCAT肽段与GST-1和GST-2的物质的量之比为横坐标,分别绘制标准曲线。被测的18O标记的QconCAT肽段的线性方程和相关系数见图6。GST-1标签定量时r2=0.99,而GST-2的r2=0.96。原因可能有两方面:一是通过TSQ重复两次检测并测得GST-1的18O平均标记效率为98.5% ,而GST-2为95.06% ;二是GST-2肽段在质谱中的响应比GST-1要低5～10倍。所以在20 ～ 200 fmoL/ μ L内,18O标记的QconCAT肽段其峰面积比与摩尔数比呈良好的线性。

图 6 18O标记的QconCAT蛋白质的定量工作曲线和相关系数 Fig. 6 Calibration curves and correlation coefficients for the 18O labeled QconCAT protein
2.5.2 内标肽段的含量

为了准确测得18O标记的QconCAT肽段的含量,选择GST-1定量。通过质谱采集的峰面积可知,GST-1的峰面积与18O标记的QconCAT内标肽段的峰面积越接近,比值越接近1,测得的QconCAT肽段的含量越准确。当1 μ L GST-1肽段(320 fmol/ μ L)与5 μ L 18O标记的QconCAT内标肽段混合(见表3)， 平均结果为:18O峰面积/GST-1峰面积=18O浓度/GST-1浓度=0.946,18O浓度为60.54 fmol/ μ L,且RSD均小于20% ,满足定量要求。

表 3 18O标记QconCAT肽段和GST-1轻标肽段峰面积比及RSD Table 3 Peak area ratios and the RSDs of QconCAT peptides labeled with 18O and GST-1 peptide labeled with 16O
2.6 实际样品腾冲嗜热菌中的应用

首先取酶切并脱盐后的腾冲嗜热菌蛋白质约2 μ g进行TSQ质谱预分析。结果表明2 μ g的腾冲嗜热菌中有很多目标蛋白质肽段的质谱信号淹没在噪声里,无法检测。考虑到TSQ的预分离色谱柱最大上样量为5 μ g,为了最大限度地定量选定的目标蛋白质,采取了以下措施:增大腾冲嗜热菌蛋白质的上样量至约4 μ g;将质谱采集时间从40 min的梯度增加到80 min;优化保留时间。随后的分析中发现,80 min梯度时鉴定到的肽段只比40 min时多一条,考虑到分析速度,所以本文选择40 min的色谱洗脱梯度。

分别取已知浓度的18O标记QconCAT肽段2、5、10、40、100、200、500、2000 fmol。将这些不同物质的量的QconCAT肽段分别加入到4 μ g的腾冲嗜热菌蛋白质酶切液中,重复测定两次。用于定量的14条肽段对应有14标准曲线,r2全部为0.99,说明在2 ～ 2000 fmol间18O标记的QconCAT肽段峰面积与物质的量比呈良好线性。以工作曲线的最低点为定量限,本方法的定量限为2 fmol/ μ L(RSD＜20% )。将腾冲嗜热菌中选定的目标蛋白质相应的肽段的峰面积带入14条线性方程中可得出其含量(见表4)。表4中所示的14个不同浓度的肽段中,3号和6号肽段的RSD值稍大于20% , 7号肽段由于浓度太低而不在线性范围内,其他肽段均满足定量要求。另外,利用标签肽段GST-1对方法的准确度进行了考察。结果当GST-1为100 fmol时,GST-1的重标母子离子对515.795/379.441与轻标母子离子对513.795/375.441峰面积比为97% ,重标母子离子对515.795/604.687与轻标母子离子对513.795/600.687的峰面积比为106% ,二者的平均值为101.5% 。当GST-1为200 fmol时,重标母子离子对515.795/379.441和轻标母子离子对513.795/375.441峰面积比为91.3% ,重标母子离子对515.795/604.687与轻标母子离子对513.795/600.687的峰面积比为100% ,二者的平均值为95.65% 。所以GST-1的准确度为98.6% ,说明该方法的准确度高,可以用于定量分析。

表 4 被测腾冲嗜热菌中目标蛋白质相应肽段的线性方程和含量 Table 4 Linear equations and contents of the peptides digested from TTE proteins
3 结论

建立了QconCAT重组蛋白质结合18O同位素标记-多反应监测质谱的蛋白质绝对定量方法。考察了QconCAT重组蛋白质和实际样本中目标蛋白质的酶切效率,以及QconCAT重组蛋白质酶切肽段的18O标记效率,结果满足蛋白质绝对定量要求。通过GST标签建立的标准曲线确定了18O标记QconCAT肽段的含量,进而对实际样本腾冲嗜热菌中选定的目标蛋白质肽段进行定量,从而实现对相应蛋白质的定量。本方法的定量限为2 fmol/ μ L且RSD小于20% ,每条曲线的线性相关系数为0.99,线性范围为3个数量级。证明该方法可以用于实际生物样品中目标蛋白质组较高通量的定量验证和确认。

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