细胞色素C(Cyt C)、转铁蛋白(Trf)、血红蛋白(Hb)、肌红蛋白(Mb)和牛血清白蛋白(BSA), pI markers (pI 10.3/7.6/5.5/4.0)和羟丙甲基纤维素(HPMC)购自Sigma公司。腾冲嗜热菌合成标准肽段由北京蛋白质组研究中心张养军老师提供,编号和氨基酸序列分别为188778 (LADLFYQSK)、188756 (GFVIYHCAVK)、188782 (TAYFAELNSYK)、188784 (TATVDDIDNIYR)、188765 (FWGFGSDGTVGANK)、188766 (AGYTAIVSHR)。载体两性电解质Pharmalyte(pH范围分别为3～10/5～8/4～6.5)购自GE Healthcare公司,精氨酸(Arg)购自北京拜尔迪生物科技有限公司,亚氨基二乙酸(IDA)购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司,NaOH、H₃PO₄、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、乙酸和尿素均为分析纯,购自北京化工厂。实验用水均为蒸馏水。

一步法需要载体两性电解质(pH 3～10)4 μ L, 20 mmol/L PBS缓冲液(pH 7.0)50 μ L;两步法需要载体两性电解质pH 3～10/4～6.5/5～8分别为4 μ L/1 μ L/1 μ L, 4 g/L HPMC 50 μ L, 500 mmol/L Arg 4 μ L, 100 mmol/L IDA 4.5 μ L, 各种蛋白质、多肽和pI marker按需要量添加,样品溶液组成以100 μ L计,其余体积用水补足。混合好的样品溶液在涡旋振荡器上混匀30 s,样品需新鲜制备。

Beckman P/ACE^TM MDQ型毛细管电泳仪配备紫外(UV)检测器(Beckman,美国); 7100毛细管电泳仪配备二极管阵列(DAD)检测器(Agilent,美国);检测波长280 nm,分离温度15 ℃。

一步法使用熔融石英毛细管(有效长度/总长:20 cm/30.2 cm,内径75 μ m),购自凯利奥拉色谱分析(邯郸)有限公司。新毛细管在使用前分别用20 mmol/L NaOH和H₂O各冲洗10 min;每两次进样间和实验结束后,用H₂O冲洗5 min。聚焦分离时,阳极和阴极所用电极液分别为200 mmol/L 的H₃PO₄和 NaOH,分离电压20 kV,分离时间10 min。

两步法采用涂层石英毛细管(有效长度/总长:20 cm/30.2 cm,内径75 μ m),购自奥泰克生物科技有限公司(河北,中国)。新毛细管在使用前分别用20 mmol/L H₃PO₄和H₂O各冲洗10 min;每两次进样间和实验结束后,依次用4 mol/L 尿素、20 mmol/L H₃PO₄和H₂O冲洗5 min。实验结束后毛细管两端用水封后于4 ℃保存。实验采用172.37 kPa气压进样1 min;聚焦时,阳极和阴极的电极液分别为200 mmol/L H₃PO₄和300 mmol/L NaOH,聚焦电压10 kV,聚焦时间5 min;分离时,阳极和阴极的电极液分别为200 mmol/L H₃PO₄和350 mmol/L 乙酸,分离电压为15 kV,同时加正向0.69 kPa气压,分离时间15 min。

一步法也称为动态聚焦法(tcIEF),是利用pH梯度和电渗流的共同作用,使样品区带在聚焦过程中迁移或者在迁移过程中聚焦。如果不采用封堵剂(如:阴极封堵剂N,N,N′,N′-四甲基二乙胺(N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine, TEMED)),其和普通CZE十分相似,迁移不受限制,即为自由迁移法。利用一步法,对pI 7.6 marker和BSA进行聚焦分离(见图1a), 6次重复实验测定的pI 7.6 marker和BSA的迁移时间的RSD分别为4.7%和4.2% 。利用单点法进行测算,得到BSA的pI为4.4。利用一步法分离BSA、Hb、Mb、Cyt C和Trf混合蛋白质时,BSA、Hb和Mb 3种蛋白质能得到快速分离,但峰形对称性较差,而Cyt C和Trf在该条件下未能检出(见图1b);利用一步法分离6种混合多肽时,多肽188765不能检出(图1c)。说明一步法可以对单种蛋白质或多肽的pI进行粗略测定,简单、快速,但是对混合组分pI的测定较难实现。

图1

Fig. 1

图 1 一步法分离蛋白质和多肽混合物的电泳图 Fig. 1 Electropherograms of mixtures of proteins and polypeptides separated by one-step cIEF a. BSA and pI 7.6 marker; b. a mixture of five proteins; c. a mixture of six polypeptides.

两步法是将样品聚焦和迁移检测过程分为两步进行,减少聚焦和分离协同作用因素的干扰,增加过程的可控性,是目前主要采用的方法。两步法中的聚焦过程是决定pI测定结果准确与否的最主要因素,因此需根据预测的样品的pI范围选用合适pH范围的载体两性电解质,并确保聚焦过程中形成稳定的pH梯度。此外,聚焦溶液中载体物质和封堵剂的种类及其组成比例也会影响聚焦实验的重复性。而聚焦电压和聚焦时间则是确保聚焦完全的两个重要因素。聚焦结束后,还需控制分离条件以确保聚焦形成的样品区带能够快速、完全地通过检测器。上述因素均影响检测结果的准确性和重现性,因而需对其进行优化。

2.2.2 聚焦电压和时间

聚焦电压和时间影响聚焦过程中两性电解质形成pH梯度的速度,也影响待测样品在毛细管内聚焦的速度,同时还影响聚焦过程中毛细管内电流和焦耳热的大小^{[ 20 ]}。本实验以pI 7.6 marker为例,对5～20 kV的聚焦电压和时间进行了考察。结果表明:随着电压的增加,迁移时间变短,聚焦电流迅速增大,二者间基本呈线性变化(见图2);当聚焦电压为10 kV，聚焦5 min时,电流明显降低且保持稳定(约5 μ A),表示聚焦完成。

图2

Fig. 2

图 2 两步法分离时聚焦电压对电流和pI 7.6 marker的迁移时间的影响 Fig. 2 Effects of focusing voltage on current and migration time of pI 7.6 marker

2.2.3 分离条件

为减轻气压驱动后因层流导致的区带展宽,可采用微弱的分离气压并维持一定低分离电压的方法^{[ 20 ]}进行分离。本实验中,以吸附性较强的Cyt C为例,对分离电压和分离气压进行了比较和优化。在2.2.2节中优化的聚焦条件下,分离气压为0.69 kPa时,待测组分能够获得较好的分离;随着分离气压由0.69 kPa增加到2.07 kPa,样品组分出峰时间提前,但分离度减小直至丧失(图3a)。由于仪器所提供的最小压力为0.69 kPa,此时也可适度增加分离电压,使待测组分的迁移加快,出峰时间提前,峰形变尖锐,且分离度却保持不变(图3b)。综合考虑分离时间和电泳效果,实验中采用了15 kV分离电压和0.69 kPa分离气压。

图3

Fig. 3

图 3 两步法分离Cyt C时(a)分离气压和(b)分离电压对分离效果的影响 Fig. 3 Effects of (a) driving pressure and (b) driving voltage on Cyt C separation by two-step cIEF

2.2.4 方法的重复性

5种蛋白质中,Trf呈现出两个峰,可以测定出两个pI值,说明其组成相对复杂。因此以Trf和肽段188766为例,考察方法的重复性(见图4)。测得pI 7.6 marker、Trf和肽段188766迁移时间的RSD均小于1.0%(n=6),表明所建立的方法重复性好。

图4

Fig. 4

图 4 两步法分离(a)Trf和(b)肽段188766的重复性 Fig. 4 Repeatabilities of (a) Trf and (b) peptide 188766 separations by two-step cIEF

2.2.5 两步法分离混合蛋白质和混合多肽

将优化的两步法条件用于单一组分的5种蛋白质和肽段的pI测定时,可得到准确的pI。用于蛋白质混合物和肽段混合物的pI测定时,应先分析4种pI marker和每种单一组分的出峰时间,再分离pI marker与5种蛋白或6种肽段的混合组分,以确定每种组分的出峰位置,其分离色谱图见图5a和b。对pI marker的pI值与其迁移时间进行二次曲线拟合(图5c和d),根据二次曲线计算所测5种蛋白质和6种多肽的pI值,结果与单组分测定时相近(见表1)。其中,结果差异较大的是蛋白质Cyt C和多肽188778、188765,三者的pI值均有0.2个pH单位的差值。对6种混合肽段进行检测时,多肽188756不能检出,但对其进行单独进样时,其出峰位置紧邻pI 7.6 marker(图5b中*处),说明其等电点应与7.6相近,其峰可能被pI 7.6 marker掩盖,二者相互干扰。

表 1 单一组分蛋白质和多肽与混合样品采用两步法测定的pI值比较 Table 1 Comparison of pI determined for single protein/polypeptide and mixtures by two-step cIEF Analyte pI determined △pI Analyte pI determined △pI Single Mixture Single Mixture Cyt C 8.4 8.2 0.2 Peptide 188756 7.4 - - Hb 7.4 7.4 0 Peptide 188778 5.1/4.3 5.3/4.5 0.2/0.2 Mb 7.3 7.3 0 Peptide 188782 5.4 5.5 0.1 Trf 6.8/6.6 6.7/6.5 0.1/0.1 Peptide 188784 4.3 4.3 0 BSA 5.3 5.3 0 Peptide 188765 5.0 5.2 0.2 Peptide 188766 8.1 8.1 0 -: could not be detected.

表 1 单一组分蛋白质和多肽与混合样品采用两步法测定的pI值比较 Table 1 Comparison of pI determined for single protein/polypeptide and mixtures by two-step cIEF

图5

Fig. 5

图 5 两步法分离(a)混合蛋白质和(b)混合肽段的色谱图及(c和d)对应的pI marker的pI值和迁移时间的曲线关系 Fig. 5 Chromatograms of mixtures of (a) proteins and (b) polypeptides by two-step cIEF and (c and d)curvilinear relationships between pI and migration time of the pI markers respectively

以BSA为例,其等电点的报道值在4.6～5.8之间。本实验中,采用一步法测定时,BSA的迁移时间约为2 min, pI值为4.4;采用两步法测定时其迁移时间约为10.5 min, pI值为5.3。一步法虽然简单,比两步法分离速度快,但测定结果不如两步法精确。

一步法分离在速度上具有明显优势,5 min之内即能完成聚焦分离全过程,可以实现对单一组分的分析,重现性好,所测pI结果比较准确。但对多种蛋白质或者多肽的混合样品则分离度不够,不能准确测定pI。如果在实际样品分析时,经区带电泳表征后发现样品组分单一,纯度较高,可以首选一步法进行测定。但因一步法分离过程受到电渗流的影响,pI与迁移距离的线性关系范围处在很狭窄的区间,因此要求pI准确测定时,建议使用一步法并需两步法进行校正。

两步法的分离体系较前者复杂,且分离时间长,但所得各组分的峰具有良好的分离度,且各组分的出峰时间与梯度pH相对应,可进行pI的准确测定。如果是未知生物样品,需先进行毛细管区带电泳表征,确定其是否为多组分混合体系,以及确定其基本组成。再采用两步法进行样品分离的条件优化,选择优化条件进行pI测定。两步法用于pI测定时,结果的准确性高于一步法。