Survryor系列液相色谱仪(美国ThermoFisher公司), TSQ Quantum Access Max三重四极杆质谱仪,配电喷雾离子源(ESI,美国ThermoFisher公司),高速匀浆机(德国IKA公司)。

乙腈(色谱纯,德国Merck公司);正己烷(农残级)、丙酮(农残级)、甲酸(色谱纯)(美国Tedia公司);氯化钠(分析纯,上海试四赫维化工有限公司);啶酰菌胺(纯度98% )、氟啶酰菌胺(纯度99% )、环氟菌胺(纯度99% )、嘧菌胺(纯度99% )、双炔酰菌胺(纯度98.5% )和硅噻菌胺(纯度98% )标准品(德国Dr. Ehrenstorfer公司);实验室用水为Milli-Q高纯水;Florisil固相萃取柱(500 mg/6 mL,美国Agilent公司)。

供试样品为大白菜、黄瓜、番茄、白萝卜、芹菜、青菜、韭菜、梨、橙子与葡萄,均购于本地的农贸市场。分别取蔬菜与水果可食用部分，切碎、匀浆后密封于-20 ℃冰箱中保存。

标准储备液:分别称取10 mg(精确至0.01 mg)的6种杀菌剂标准品,用乙腈溶解并定容至10 mL,配制成质量浓度为1 g/L的标准储备液,于-20 ℃冰箱中保存。

混合标准工作溶液:用含0.1%甲酸的乙腈溶液将上述标准储备液稀释,配成含6种杀菌剂均为100 mg/L 的混合标准工作溶液,使用时用乙腈逐级稀释成所需浓度的工作溶液。

对1.0 mg/L 待测化合物的单标准溶液以流动注射的方式进行母离子全扫描,结果显示在正离子化模式下,6种杀菌剂均可形成稳定的[M+H]⁺峰。经一级质谱优化,确定了喷雾电压、鞘气压力、离子传输管电压等质谱参数;通过二级质谱扫描,优化各杀菌剂的子离子及其碰撞能量等参数,选择1个母离子以及其相应的4个子离子,然后在含基质条件下进行MRM扫描,最终从相应的4个离子中选择灵敏度高且干扰小的2个离子,以强度较高者为定量离子,较低的为定性离子,具体参数见表1。

改善分离条件使目标物与样品杂质有效分离是消除或降低基质效应的重要手段^{[ 17 ]}。采用填料为1.8 μ m的超高压色谱柱虽可获得超高的柱效,但同时也会产生很高的反压而无法在普通液相色谱系统中使用。本文采用新型填料的Poroshell 120 EC-C₁₈色谱柱,其填料采用熔融核/核壳(Fused-core)技术制备,具有亚2 μ m柱类似的高柱效^{[ 18 ]}。在相同条件下与1.8 μ m超高压色谱柱相比,该新型色谱柱的柱压可低40% ～50% 。实验表明6种新型酰胺类杀菌剂在反相色谱柱上均有较强的保留,但直接采用高比例有机相进行等度洗脱时不能有效分离,共流出杂质多,基质效应明显。因此本实验采用两次梯度对目标化合物进行洗脱,取得良好的分离效果,且基质效应得到明显降低。首先,在3 min内流动相乙腈由20%上升至60% ,使极性较强的基质组分先被洗脱分离出来,然后在10 min内使乙腈缓慢增加至80% 。从上述优化的条件下获得的0.5 μ g/L 目标物总离子流图及质谱图可以看出6种新型酰胺类杀菌剂获得了基线分离(见图1),基质效应也较低,整个分离过程可在18 min内完成,实现了在普通液相色谱系统上的超高柱效分离。

图1

Fig. 1

图1 目标物(0.5 μ g/L)的总离子流图及各化合物的质谱图 Fig.1 Total ion current chromatogram and mass spectra of the six amide fungicides (0.5 μ g/L) a. mandipropamid; b. boscalid; c. fluopicolide; d. mepanipyrim; e. silthiofam; f. cyflufenamid.

通过良好的样品净化步骤除去样品基质中的干扰组分,可以很好地降低基质效应。QuEChERS法虽然因简单、快速等特点而广泛用于农残分析,但其主要缺点是净化效果差,某些农药会产生较强的基质效应^{[ 19 ]};而固相萃取虽操作相对复杂,但净化效果通常较好。本文基于6种酰胺类杀菌剂均属于弱极性化合物的特点,选择硅镁型吸附剂Florisil固相萃取柱对样品进行净化。试验优化Florisil固相萃取柱条件,以10 mL不同体积比(10 ∶ 90、20 ∶ 80、30 ∶ 70、40 ∶ 60、50 ∶ 50、60 ∶ 40、70 ∶ 30)的丙酮-正己烷进行洗脱液的选择。结果表明,双炔菌胺在Florisil柱上有较强的吸附,当丙酮与正己烷的体积比为40 ∶ 60时才可以完全被洗脱,而其他5种杀菌剂在丙酮与正己烷的体积比为10 ∶ 90时即可被洗脱下来。随着丙酮比例的增加,洗脱下来的杂质也增多。综合净化效果和回收率的试验结果,最终选择丙酮-正己烷(40 ∶ 60, v/v)的混合液为洗脱溶剂。

此外,本文选用白菜、韭菜、黄瓜、橙子、梨等10种基质,分别采用改进的QuEChERS法和本文建立的Florisil固相萃取方法进行比较,评价其对酰胺类杀菌剂的净化效果。净化效果以基质效应ME(matrix effect, ME=B/A×100% )^{[ 20 ]}来衡量,其中B为基质匹配标准溶液(5 μ g/kg)的响应值;A表示目标物在纯溶剂中的响应值。改进的QuEChERS 法参照曹赵云等^{[ 21 ]}建立的方法,Florisil固相萃取按1.4.2节进行。试验结果分别见图2和图3。

图2

Fig. 2

图2 6种杀菌剂经改进的QuEChERS法净化后的基质效应 Fig.2 Matrix effect of the six amide fungicides in the different matrices purified by modified QuEChERS

图3

Fig. 3

图3 6种杀菌剂经Florisil固相萃取柱净化后的基质效应 Fig.3 Matrix effect of the six amide fungicides in the different matrices purified by a Florisil SPE column

从图2看出,采用改进的QuEChERS方法提取净化后,6个目标物在10种基质中均表现出较为明显的基质效应。而从图3看出,提取液经Florisil净化后,6个目标物的基质效应得到明显降低,其回收率在86% ～106%之间。对比改进的QuEChERS法可见,本文建立的Florisil固相萃取净化方法,对去除水果、蔬菜中的基质干扰物质效果较好,能满足6种新型酰胺类杀菌剂的分析要求。

将6种酰胺类杀菌剂混合标准溶液分别稀释成质量浓度为0.5、5、20、50、100 μ g/L 的标准工作溶液,在优化的色谱和质谱条件下进行测定,以酰胺类杀菌剂各组分质量浓度为横坐标(x, μ g/L),定量离子对的峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线,得到的线性方程和相关系数见表2。结果表明,目标分析物在0.5～100 μ g/L 质量浓度范围内具有较好的线性关系且各分析物标准曲线的相关系数均不低于 0.9990。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 6种酰胺类杀菌剂的线性方程、相关系数(r)、检出限与定量限 Table 2 Linear equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the six amide fungicides Analyte Linear equation r LOD/( μ g/kg) LOQ/( μ g/kg) Cyflufenamid y=-3721.51+50076.1x 0.9991 0.15 0.45 Silthiofam y=-208.337+198707x 0.9996 0.15 0.45 Mepanipyrim y=387.993+75314.3x 0.9990 0.10 0.30 Fluopicolide y=-7720.9+45425x 0.9993 0.17 0.51 Boscalid y=-2802.71+8423.38x 0.9991 0.15 0.45 Mandipropamid y=-3978.32+61019.5x 0.9995 0.15 0.45 y: peak area of quantitative ion; x: mass concentration of the analyte, μ g/L. Linear range: 0.5-100 μ g/L for each analyte.

表2 6种酰胺类杀菌剂的线性方程、相关系数(r)、检出限与定量限 Table 2 Linear equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the six amide fungicides

在空白样品中添加6种酰胺类农药标准溶液,按确定的方法测定,以S/N≥3确定方法的检出限(LOD)。以S/N≥10确定方法的定量限(LOQ)。结果如表3所示,6种酰胺类杀菌剂的LOD范围为0.10～0.17 μ g/kg, LOQ范围为0.30～0.51 μ g/kg。

在不含目标物的黄瓜、番茄、大白菜、芹菜、萝卜、青菜、韭菜、橙子、梨、葡萄的10种基质中添加0.5、5、50 μ g/kg 3个水平的混合标准溶液，进行加标回收试验,得到的平均回收率和精密度(n=5)见表3。结果表明,6种目标分析物的平均回收率为65% ～124% ,相对标准偏差(RSD)为1% ～18% 。其中黄瓜样品中0.5 μ g/kg 添加水平下的提取离子色谱图见图4。从图4中可以看出空白样品的背景未干扰目标分析物的测定,不影响实际样品中6种酰胺类杀菌剂的定性和定量分析。

利用本文建立的方法对30份蔬菜和20份水果进行测定,其中6份以添加标准样品(100 μ g/kg 的加标水平)的方式用于过程控制。结果表明:所测样品中均未检出6种酰胺类杀菌剂,且质量控制样品的监测结果稳定可靠,回收率为96% ～102% , RSD为1% ～5% 。

图4

Fig. 4

图4 6种杀菌剂在黄瓜(a)空白样品和(b)加标样品(0.5 μ g/kg)中的LC-MS/MS选择离子色谱图 Fig.4 Selected ion chromatograms of the six fungicides in (a) a blank cucumber sample and (b) the sample spiked with the six fungicide standards at 0.5 μ g/kg

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 10种样品中酰胺类杀菌剂的加标回收率和相对标准偏差(n=5) Table 3 Recoveries and the relative standard deviations (RSD) of the six amide fungicides spiked in ten matrices (n=5) Analyte Spiked/( μ g/kg) Cyflufenamid Silthiofam Mepanipyrim Fluopicolide Boscalid Mandipropamid Recovery RSD Recovery RSD Recovery RSD Recovery RSD Recovery RSD Recovery RSD Cucumber 0.5 113 14 98 9 71 9 79 3 65 18 109 17 5 88 8 103 5 105 7 102 11 102 9 106 9 50 94 5 92 7 124 4 101 4 97 8 105 6 Cabbage 0.5 80 15 71 16 70 18 76 12 106 16 73 15 5 93 8 86 4 93 12 117 6 86 15 73 6 50 102 5 90 9 115 11 110 11 103 12 105 9 Tomato 0.5 76 17 80 16 74 5 101 18 65 18 72 11 5 113 10 94 4 92 4 100 8 100 10 74 12 50 93 5 81 8 110 6 107 2 92 10 97 3 Radish 0.5 67 5 75 14 70 18 100 15 76 13 94 18 5 98 7 89 5 82 9 83 13 93 7 98 3 50 97 5 86 5 86 3 104 1 94 3 97 3 Celery 0.5 65 14 92 5 65 12 102 18 75 13 121 14 5 91 6 93 4 96 8 104 9 94 5 103 3 50 86 7 87 9 87 9 91 11 74 13 109 12 Pear 0.5 96 13 105 5 75 14 110 5 120 11 88 14 5 90 7 98 7 86 9 78 7 68 12 66 11 50 92 12 86 13 116 11 108 12 90 11 101 10 Orange 0.5 70 13 98 12 68 10 94 11 69 16 67 16 5 71 10 78 6 69 8 78 9 70 13 69 11 50 95 6 89 5 92 3 89 7 82 5 75 9 Grape 0.5 91 15 87 9 75 12 88 13 106 18 106 16 5 96 8 81 12 70 9 96 4 86 9 72 12 50 99 10 85 10 97 11 99 9 92 11 85 10 Greengrocery 0.5 106 16 101 15 89 12 73 3 107 8 88 7 5 100 10 109 6 98 8 101 15 89 3 101 15 50 99 9 95 7 95 4 92 6 97 6 90 8 Chives 0.5 84 14 104 18 82 7 108 10 96 8 114 7 5 94 9 110 3 88 10 96 9 65 6 99 13 50 101 9 105 1 96 4 97 2 85 7 112 10

表3 10种样品中酰胺类杀菌剂的加标回收率和相对标准偏差(n=5) Table 3 Recoveries and the relative standard deviations (RSD) of the six amide fungicides spiked in ten matrices (n=5)