随着人们对健康和环保要求的不断提高,纺织品中可能使用的致癌染料对人体及环境的生态毒性和安全性问题日益突出,生态纺织品的概念逐渐融入人们的生活。生态纺织品是采用对周围环境无害或少害的原料制成并对人体健康无害的纺织产品。目前,欧盟委员会的2009/567/EC指令[ 1 ]和每年更新一次的国际纺织环保协会的Oeko-Tex Standard 100[ 2 ]都禁止在纺织品中使用以下9种致癌染料：酸性红26、直接红28、碱性红9、碱性紫14、直接黑38、直接蓝6、分散蓝1、分散橙11、分散黄3,检测方法定量限规定为50 mg/kg。2009年我国颁布了国家标准《生态纺织品技术要求》(GB/T 18885-2009),该标准参照Oeko-Tex Standard 100(2008版)的全部内容,对生态纺织品中的致癌染料做了相同的限制要求。
近年来,许多专家学者开展了纺织品中致癌染料的分析方法研究。纺织品中致癌染料的测定方法主要有高效液相色谱-二极管阵列检测法[ 3 ]、高效液相色谱-质谱法[ 4 ]及高效液相色谱-串联质谱法[ 5 ]。染料产品的化合物信息不明确,组成复杂,既含有目标物及其同分异构体,还含有未反应的中间体和大量的助剂,部分标准品也是如此。液相色谱法不仅在色谱分离上难度很大,而且无法很好地解决杂质干扰和吸光度差异的问题;基于低分辨质谱的检测方法则很可能将含量较高的杂质误认为是待测化合物,容易出现定量和定性方面的偏差。本文应用的Orbitrap静电场轨道阱质谱(Orbitrap MS)是一种新兴的高分辨质谱,目前已广泛应用于蛋白质组学、代谢组学、脂质分析、药物控制和食品安全等领域的小分子和大分子研究[ 6, 7, 8, 9 ],但将Orbitrap高分辨质谱技术应用于纺织品中有害物质的检测尚未见报道。本文建立了高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱(HPLC-LTQ/Orbitrap MS)筛查和确证纺织品中致癌染料的分析测定方法,并应用于实际样品的检测。
ACQUITY Ultra Performance LC超高效液相色谱仪(Waters公司), LTQ-Orbitrap XL线性离子阱-静电场轨道阱组合质谱仪(Thermo公司); MS 3 basic漩涡振荡器(德国IKA公司); SHA-B型恒温振荡器(国华仪器); 0.22 μ m聚四氟乙烯(PTFE)薄膜过滤头(DIKMA公司);实验用水均为超纯水(Millipore公司);甲醇、乙腈(色谱纯,Merck公司);甲酸(色谱纯,Fluka公司);乙酸铵(色谱纯,Mallinckrodt Baker公司);吡啶(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)。
酸性红26(纯度70% ),碱性紫14、直接黑38、直接红28(纯度97% )和直接蓝6购自美国Sigma-Aldrich公司;碱性红9(纯度94.5% )、分散橙11(纯度95% )、分散黄3(纯度30% )、分散蓝1(纯度30% )购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。分别准确称取适量的各染料标准品,用甲醇溶解并定容,配制成有效浓度为200 mg/L 的标准储备液,于-18 ℃下保存。使用时,用甲醇/水(1/1, v/v)逐级稀释成混合标准中间液,现用现配。
参照ISO(国际标准化组织)标准草案[ 10 ]前处理方法:将样品剪碎至5 mm×5 mm以下,称取0.5 g(精确到0.01 g),加入20 mL吡啶/水(1/1, v/v),在95 ℃水浴中振荡(150 r/min)提取30 min,冷却至室温,静置,取上清液用甲醇/水(1/1, v/v)稀释12.5倍,过0.22 μ m PTFE膜,滤液待分析。
日本资生堂CAPCELL PAK UG120 C18色谱柱(100 mm×2.0 mm, 5 μ m);正离子模式下的流动相A为5 mmol/L 乙酸铵水溶液(含0.01%甲酸), B为乙腈;负离子模式下的流动相A为5 mmol/L 乙酸铵水溶液,B为乙腈;线性梯度洗脱程序:0～5.00 min, 90%A～10%A,保持5.00 min;10.00～10.10 min, 10%A～90%A,保持至15.00 min。流速0.25 mL/min;柱温:30 ℃;样品室温度:15 ℃;进样量:10 μ L。
可加热的电喷雾离子源(HESI-II);毛细管温度为350 ℃,鞘气(N2)压力206.7 kPa(即30 arb),辅助气(N2)流量3.3 L/min(即10 arb);正离子模式:喷雾电压为3 kV,毛细管电压为30 V,透镜电压(tube lens)为80 V;负离子模式:电喷雾电压为2.5 kV,毛细管电压为-10 V,透镜电压为-50 V。正、负离子模式分别采集数据。
扫描方式(平行模式):全扫描的分辨率R=30000;数据依赖扫描(data-dependent scan)的二级质谱采用碰撞诱导解离(CID)产生碎片,归一化碰撞能量为35% 。
9种致癌染料的HPLC-LTQ/Orbitrap MS分析参数列于表1。化合物筛选的离子提取窗口宽度为5×10-6(5 ppm)。9种染料的提取离子色谱图见图1。直接蓝6的提取离子色谱图中出现两个色谱峰,为其两种同分异构体。
本文研究的9种致癌染料分属酸性染料、碱性染料、直接染料和分散染料,各染料的化学性质相差很大。一些学者对标准溶液的分组问题进行了研究:王建平等[ 11 ]认为在用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)分析9种致癌染料时,需要同时考虑色谱分离、阴离子和阳离子化合物不能混合、标准物质互含等情况,将混合标准溶液(2 mg/L)分为4组;Ding等[ 12 ]则根据致癌染料在溶液中的电荷状态不同及每种染料在ESI源中检测模式的不同,将标准工作溶液分成2组。
本实验配制9种致癌染料的混合标准溶液(4 mg/L),在配制当天与各个物质的单标准溶液进行峰面积比较,之后将混合标准溶液和9个单标准溶液于4 ℃下避光保存45 d,再进行峰面积比较。数据结果表明:9种致癌染料在混合标准溶液中的峰面积和各自的单标准溶液的峰面积基本相当,比值范围在87% ～110%之间。因此可以推断:在4 mg/L 水平下,9种致癌染料的混合标准溶液于4 ℃下避光存放45 d内,对定量无大的影响。
参考已有文献[ 5, 12, 13],本文采用反相色谱(CAPCELL PAK C18柱)进行色谱分离,有机相选用乙腈,水相考察了不同pH值的乙酸铵缓冲溶液(即5 mmol/L 乙酸铵水溶液(pH约为6.38)、5 mmol/L 乙酸铵水溶液(含0.01%甲酸,pH约为4.45)和5 mmol/L 乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸,pH约为3.26))对9种染料的色谱行为和质谱响应的影响。结果表明:在ESI+模式下,采用5 mmol/L 乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)作流动相的水相时,直接红28峰拖尾严重,信噪比较差;而采用5 mmol/L 乙酸铵水溶液和5 mmol/L 乙酸铵水溶液(含0.01%甲酸)时,色谱峰峰形基本一致,但5 mmol/L 乙酸铵水溶液(含0.01%甲酸)的质谱响应较高。直接黑38的情况与直接红28基本一致。碱性染料和分散染料在3种pH值流动相条件下都能获得良好的峰形,但是5 mmol/L 乙酸铵水溶液(含0.01%甲酸)的质谱响应较高。故本文选择5 mmol/L 乙酸铵水溶液(含0.01%甲酸)作为正离子模式的水相流动相;在ESI-模式下分析,以5 mmol/L 乙酸铵水溶液作流动相的水相时,酸性红26的峰面积和峰高最大,峰形较另两种流动相对称,其他染料的色谱行为与酸性红26类似,故选择5 mmol/L 乙酸铵水溶液作为负离子模式的流动相水相。
采用的色谱柱填料的粒径越小,一般情况下获得的分离度、样品通量和灵敏度越高,由于色谱分离速度需与Orbitrap高分辨质谱采集速度相适应,本文以乙腈-5 mmol/L 乙酸铵水溶液(含0.01%甲酸)和乙腈-5 mmol/L 乙酸铵水溶液分别作为正、负离子模式的流动相,分别考察了ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μ m)、Hypersil GOLD C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 3 μ m)和CAPCELL PAK C18色谱柱(100 mm×2.0 mm, 5 μ m)对9种染料的色谱分离行为和质谱兼容情况的影响。除分散蓝1只能在CAPCELL PAK C18色谱柱上获得较为对称的峰形外,其他8种染料在3个色谱柱上都能获得良好的峰形。采用1.7 μ m粒径的色谱柱与3 μ m和5 μ m粒径的色谱柱相比,得到了较窄的色谱峰宽和较高的色谱峰高,但在质谱分辨率R=30000 进行高分辨质谱采集时,一个色谱峰内的数据采集点数较少(部分化合物少于9点),容易出现定量不准确的情况,而选用5 μ m的CAPCELL PAK C18色谱柱,色谱峰的峰面积在3种不同粒径的色谱柱中最大,由于其色谱峰宽较宽,相同质谱扫描速度下的采集点数最多,因此,本实验考虑在不影响灵敏度并保证定量准确的情况下,选择了5 μ m的CAPCELL PAK C18色谱柱。
致癌染料中的直接染料和酸性染料均为含有多个磺酸基的钠盐化合物,质谱分析时为典型的多电荷物质。质谱厂家离子源设计的差异和流动相组成的不同可能导致了文献中报道的酸性红26[ 5, 12, 13 ]和直接黑38[ 5, 12 ]的母离子不同。此外,有文献报道:含磺酸基的化合物的典型质谱离子化离子除[M-nNa]n-和[M-nNa+(n-1)H]-外,还有诸如[M-xH-ySO3]z-及[M-xH-ySO3+zNa]n-等形式的离子[ 14 ]。本实验分别在ESI+和ESI-模式下,采用流动注射方式,对9种致癌染料进行高分辨全扫描,选择合适的离子化模式和质谱响应较强的特征母离子。实验优化结果表明:碱性红9和碱性紫14等含氯染料的母离子为[M-Cl]+, 3种分散染料的母离子为[M+H]+,这两类染料仅能在正离子模式下获得良好的质谱响应,且均未出现[M+NH4]+、[M+Na]+、[M+K]+等其他特征母离子峰;在负离子模式下,酸性红26、直接红28、直接黑38和直接蓝6等4种多电荷染料均有2种以上特征母离子,并未发现文献报道的脱磺酸基的特征母离子,通过不同加合方式得到的母离子及相对丰度列于表2;而酸性红26、直接红28和直接黑38在正离子模式下也有较强响应,特征母离子为[M-nNa+(n+1)H]+,本方法采用高分辨质谱全扫描模式进行质谱采集,因此这3种物质在正、负离子模式下均可在扫描范围内检测,同时也提高了化合物的定性确证水平。
此 外,现有文献[ 12, 13, 15, 16]中对分散蓝1的母离子的报道情况也有争议。基于单位质量分辨质谱的分析研究,有人选用m/z 268作为母离子,也有人选用m/z 269作为母离子,显然对于唯一确定的物质,这两种情况互为矛盾。根据相关法规中的分散蓝1的信息,通过CAS号在权威的SciFinder数据库中查询其化合物信息,得到该化合物的分子式为C14H12N4O2, [M+H]+母离子的精确理论质量数应为 269.10330。
针对部分学者误将m/z 268作为分散蓝1的母离子的问题,本实验将分散蓝1的标准溶液在Orbitrap高分辨质谱进行流动注射,从一级全扫描质谱谱图(见图2a)可以看到杂质m/z 268的丰度约为待测物分散蓝1的5倍,很容易发生指认化合物错误的情况,将m/z 268误认为是分散蓝1的[M+H]+峰,将m/z 269误认为是分散蓝1的[M+H]+峰的13C同位素峰。
同时本实验还发现,杂质m/z 268的13C同位素峰(m/z 269.09912)与实际的分散蓝1的[M+H]+峰(m/z 269.10330)非常接近(图2b),只有在质谱分辨率R≥100000 时,这两个物质的质谱峰才能被有效地区分。从已有报道和本实验研究可以猜测,不论在工业染料成品,还是在标准物质纯品中,杂质m/z 268均伴随着分散蓝1的出现而出现,而其与分散蓝1的成分组成是否为一个大致的比例尚不清楚,杂质对于分散蓝1在检测过程中的准确定量可能存在影响。本实验还试图通过杂质m/z 268的精确母离子(m/z 268.09539)及其CID碎裂的二级碎片或三级碎片离子(m/z 223.07437、240.09651、253.08497 等)进行物质信息结构反推,目前尚未得出可靠的结论。
LTQ-Orbitrap XL线性离子阱/静电场轨道阱组合式质谱仪可以提供CID和HCD(高能碰撞诱导解离)两种碰撞裂解模式。与CID碰撞模式相比,HCD碰撞能有效产生低质量端的子离子碎片[ 17, 18, 19 ]。本实验分别采集了9种致癌染料在归一化碰撞能量为35%时的CID和HCD高分辨质谱谱图,并进行了比较:在CID碰撞模式下,归一化碰撞能量设为35%时,9种染料都能产生较强的碎片离子,而在相同能量下采用HCD碰撞模式,部分染料化合物不能产生有明显响应的碎片离子。以碱性紫14为例,当CID和HCD的归一化碰撞能量都为35%时,在HCD模式下没有产生碎片离子,而在CID模式下产生了m/z 209.10770 和 195.09206 的碎片离子(见表3)。对碱性紫14的HCD碰撞能量进行优化,以横坐标为碰撞能量,纵坐标为所有碎片离子强度之和,发现该图中碎片离子强度之和随着碰撞能量的增大而增大,当HCD碰撞能量为77%时,碎片离子强度之和最大,此时有碎片离子m/z 209.10773、195.09207 和 286.13438 等;此外,虽然在低质量数端,HCD能有效改善CID裂解中的“三分之一效应”,但本实验的9种致癌染料中,除了直接红28,其他8种染料在m/z 50至“三分之一”之间均不存在碎片离子。本研究在建立致癌染料分析方法时,选择CID作为二级碎片碰撞裂解模式。
采用Orbitrap高分辨质谱对9种致癌染料进行定量分析,根据各化合物的响应情况,将9种致癌染料的标准溶液用甲醇/水(1/1, v/v)稀释成合适浓度的系列标准工作液,以染料的浓度和峰面积绘制标准曲线。由于高分辨质谱提取精确质量数,故基线噪声极低,以S/N计算的检出限和定量限与方法的真实性能可能存在差距,因此,本实验用空白基质提取液逐级稀释标准溶液至仪器所能检出的最低浓度,换算为方法的检出限。9种致癌染料的线性范围、相关系数及检出限见表4。
选取日常生活中常见的纯棉布、纯涤布、棉涤混纺布等3种材料作为天然纤维、合成纤维、混纺纤维的典型代表基质,依据Oeko标准对纺织品中致癌染料检测定量限的规定(50 mg/kg),在空白样品中进行了25、50和100 mg/kg 等3个添加水平的加标回收试验,每个水平进行6次重复测定,测得纯棉布、纯涤布、棉涤混纺布中9种致癌染料的回收率范围为62.13% ～116.28% ,相对标准偏差小于15%(见表5)。
对于纺织品中致癌染料的检测,常用的低分辨质谱方法由于质量精度低以及标准品中响应较高的杂质的干扰可能会引起假阳性;而高分辨质谱分辨率高,能提供精确质量数,在对未知物进行筛查时,是基于保留时间及二级碎片离子的精确质量数确认,因此可大大降低假阳性的出现率,显著提高方法的选择性。
本文利用建立的方法对20余个纺织品样品(纤维涉及纯棉、纯涤、麻、棉涤混纺、棉涤腈纶混纺纤维等)进行了9种致癌染料的检测,其中1个纯棉样品检出直接红28,全扫描一级母离子定量其含量约为900 mg/kg,图3a、3b和3c分别为该样品中直接红28在正离子模式下的色谱图、一级母离子质 谱图和二级CID碎片质谱图,图3d为直接红28标 准溶液的二级CID质谱图。图3b显示:实测直接红28的母离子为m/z 653.12885,其质量准确度为2.6×10-6(2.6 ppm),符合欧盟相关法规[ 20 ]对高分辨质谱定性确认的质量准确度要求(小于5×10-6 (5 ppm))。将实测二级质谱图(图3c)与标准溶液的二级质谱图(图3d)进行比对,碎片离子及其相对丰度基本一致,各主要碎片离子的质量准确度也在5×10-6(5 ppm)以内。参照欧盟 2002/657/EC[ 21 ]中对质谱定性的相关规定:使用高分辨质谱时,1个母离子可获得的识别点是2.0,1个子离子可获得的识别点是2.5,因此通过采用直接红28的一级母离子和二级CID碎片离子的精确质量数进行样品定性,可获得大于10个识别点的定性分数,这远远超出了欧盟 2002/657/EC对禁用药物准确定性需至少满足4个识别点的规定。
本研究建立的纺织品中致癌染料的高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱筛查和确证方法简便、快速、高通量,其选择性高、抗干扰性好、定性结果准确可靠,目前已应用于纺织品样品的日常检测中。
2013, Vol. 31 Issue (10): 961-968
PDF (873KB)
2013, Vol. 31 Issue (10): 961-968
PDF (873KB)