色谱  2013, Vol. 31 Issue (11): 1064-1070   PDF (1700KB)    
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郭成叶
王后禹
张雷
樊柳荫
曹成喜
可视化移动反应界面滴定法测定豆浆中蛋白质的含量
郭成叶1,2, 王后禹2, 张雷1 , 樊柳荫2, 曹成喜2     
1. 上海师范大学生命与环境科学学院, 上海 200234;
2. 上海交通大学生命科学技术学院, 微生物代谢国家重点实验室, 上海 200240
收稿日期：2013-04-23
基金项目：科技部重大仪器专项基金项目(2011YQ030139);国家自然科学基金项目(21275099,21035004).
通讯作者：张雷,E-mail:chemzl@shnu.edu.cn;曹成喜,E-mail:cxcao@sjtu.edu.cn.
摘要：利用移动反应界面滴定(moving reaction boundary titration, MRBT)技术可视化快速准确测定豆浆中的总蛋白质含量。在MRBT中,移动反应界面(moving reaction boundary, MRB)是由阴极液中的氢氧根离子和固定在聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel, PAG)中的豆浆蛋白质分子形成,通过酸碱指示剂来指示MRB的移动。利用MRB移动速度(VMRB)与蛋白质浓度存在的函数关系建立标准曲线。配对t检验MRBT测定结果与凯氏定氮相比在95%的置信区间内无显著性差异。MRBT测定所需时间为10 min左右,线性范围为2.0~14.0 g/L,检出限为0.05 g/L,日内相对标准偏差小于1.90%,日间相对标准偏差小于4.39%,回收率为97.41%~99.91%。此外,三聚氰胺等非蛋白质氮(non-protein nitrogen, NPN)的添加,对豆浆中蛋白质的测定结果影响较小。
关键词： 移动反应界面     电泳     滴定     总蛋白质含量     豆浆    
Determination of total protein content in soya-bean milk via visual moving reaction boundary titration
GUO Chengye1,2, WANG Houyu2, ZHANG Lei1 , FAN Liuyin2, CAO Chengxi2     
1. College of Life and Environmental Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China;
2. School of Life Sciences and Biotechnology of Shanghai Jiao Tong University, State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Shanghai 200240, China
Received: 2013-04-23
Abstract: A visual, rapid and accurate moving reaction boundary titration (MRBT) method was used for the determination of the total protein in soya-bean milk. During the process, moving reaction boundary (MRB) was formed by hydroxyl ions in the catholyte and soya-bean milk proteins immobilized in polyacrylamide gel (PAG), and an acid-base indicator was used to denote the boundary motion. The velocity of MRB has a relationship with protein concentration, which was used to obtain a standard curve. By paired t-test, there was no significant difference of the protein content between MRBT and Kjeldahl method at 95% confidence interval. The procedure of MRBT method required about 10 min, and it had linearity in the range of 2.0-14.0 g/L, low limit of detection (0.05 g/L), good precision (RSD of intra-day<1.90% and inter-day<4.39%), and high recoveries (97.41%-99.91%). In addition, non-protein nitrogen (NPN) such as melamine added into the soya-bean milk had weak influence on MRBT results.
Key words: moving reaction boundary     electrophoresis     titration     total protein content     soya-bean milk    
凯氏定氮法是测定牛奶、豆浆等食品中蛋白质含量的标准方法[ 1 ]之一,而它除了操作复杂、测定时间较长外,还容易受非蛋白质氮(non-protein nitrogen, NPN)的影响。若用凯氏定氮法检测已掺杂NPN(如三聚氰胺、尿素等)的乳制品或豆制品,测得的蛋白质含量会比实际值高[ 2 ]。而摄入过多的三聚氰胺会引起肾结石、血尿等疾病,最后可能导致急性肾功能衰竭[ 3 ];尿素的添加会降低食品营养价值,对人的身体也会造成损害[ 4 ]。根据中华人民共和国国家标准(GB/T 22106-2008非发酵豆制品)规定,纯豆浆的蛋白质含量≥20 g/kg,调味豆浆的蛋白质含量≥18 g/kg[ 5 ]。因此,有必要建立一种快速简单的蛋白质含量测定方法,同时该方法不受非蛋白质氮的干扰。

由沉淀反应界面[ 6 ]、静止中和界面[ 7 ]发展而来的移动反应界面(moving reaction boundary, MRB)理论已经有了较广泛的应用[ 8, 9 ]。近年来,Yang等[ 10 ]和王后禹等[ 11 ]提出了移动反应界面滴定(moving reaction boundary titration, MRBT)技术用于测定酸碱浓度,其MRB由强酸和强碱形成。Guo等[ 12 ]利用MRBT技术测定了牛奶中的蛋白质含量,其MRB由强碱和固定在聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel, PAG)中的牛奶蛋白质分子形成。而豆浆中的蛋白质在组成、含量和分析参数上与牛奶中的蛋白质有着明显的差异[ 13 ], Guo等建立的方法不能直接应用于豆浆中蛋白质含量的测定。本文建立了一种快速、简单又不受非蛋白质氮干扰的测定豆浆中总蛋白质含量的MRBT方法。

图1为MRBT的原理示意图。在图1中,豆浆样品中的蛋白质分子通过具有高交联度的PAG均匀地固定在电泳管中;阴极电泳槽中含有碱溶液。在外加电场作用下,碱溶液中的OH-移向阳极,而蛋白质分子由于被高交联度的PAG固定在电泳管中既不能向阳极移动也不能向阴极移动。组成蛋白质的游离酸性残基的氨基酸如Asp、Glu、Tyr和Cys在高于其pKa的环境中电离出H+,带负电荷[ 14 ]。在pH 12.30(如0.02 mol/L NaOH溶液中)时,可以被OH-完全中和生成水,进而在碱( α 相)和蛋白质( β 相)之间形成MRB。电泳过程中,由于阴极端OH-的高通量,MRB由阴极移向阳极。MRB移动速度(VMRB)为:

VMRB=D2-1/t2-1 (1)

其中D表示界面移动的距离(D2-1=D2-D1), t表示电泳时间(t2-1=t2-t1)。

图 1 移动反应界面滴定(MRBT)原理示意图 Fig. 1 Schematic diagram of moving reaction boundary titration (MRBT) D1: the distance of moving reaction boundary (MRB) movement at the run time t1; D2: the distance of MRB movement at the run time t2.

多种酸碱指示剂已被用于检测H+和OH-的电迁移[ 15, 16 ]。因此,在电泳管中加入酸碱指示剂可指示不同时间下MRB所处的位置,从而实现可视化观测。固定的蛋白质可以阻滞MRB的迁移,蛋白质浓度越高,MRB受到的阻滞越大,迁移越慢,因此VMRB与蛋白质浓度之间可能存在着一定的函数关系。



1 实验部分
1.1 仪器与试剂

自动定氮仪(Medel KDN-103F型,上海纤检仪器有限公司)。MRBT法测定豆浆中蛋白质所用实验装置的组成与操作见文献[ 11, 12 ]。

邻苯二甲酸氢钾、过硫酸铵、氢氧化钠(NaOH)、氯化钾(KCl)、三聚氰胺和尿素,均为分析纯;酚酞,化学纯;以上试剂购于上海化学试剂有限公司。丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)购于美国Sigma公司。配制2.0 mol/L KCl溶液及0.2 mol/L NaOH溶液,用邻苯二甲酸氢钾标定;配制聚丙烯酰胺凝胶溶液(30.0%T(total concentration)，4.0%C(cross-linker)): 28.8 g丙烯酰胺与1.2 g N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶于水,定容至100 mL; 100 g/L 的过硫酸铵和TEMED分别用作凝胶聚合的催化剂和促凝剂。所有溶液均用去离子水制备。

1.2 样品前处理

分别取一定量的4种市售大豆:宝粒来(Bao Li Lai,产自吉林省长春市)、有机农庄(You Ji Nong Zhuang,产自山东省潍坊市)、禾煜(He Yu,产自黑龙江省牡丹江市)、盛龙(Sheng Long,产自江苏省大丰市)。用去离子水水化24 h,洗净后沥干；称取70 g放入九阳豆浆机(DJ12B-A11DEC型)中,准确加入1 L水,在96～98 ℃下提取蛋白质并制取豆浆。根据MRBT法测定蛋白质原理,VMRB只与蛋白质分子所含的游离酸性残基数有关,因此蛋白质变性不影响最终的定量结果。


1.3 凯氏定氮法

凯氏定氮法参考文献[ 1 ]。70 g水化大豆中加入1 L水制取豆浆。用凯氏定氮法测得宝粒来、有机农庄、禾煜和盛龙大豆制作的豆浆中的蛋白质质量浓度分别为15.5、14.1、14.7和14.3 g/L。

1.4 MRBT法

电场强度 2000 V/m, NaOH浓度0.02 mol/L,电极液离子强度0.1 mol/L。2 mL含有待测豆浆样品的凝胶溶液(15.0%T, 4.0%C)，加入KCl溶液(终浓度为0.1 mol/L)和酚酞(变色范围为pH 8～10)(终质量浓度为0.025 g/L)，混合均匀(其时pH 7左右),注入电泳管中。阳极液的组成为0.1 mol/L KCl (pH 7.0),阴极液的组成为0.02 mol/L NaOH和0.08 mol/L KCl (pH 12.3)。在外加电场下,OH-向阳极移动,与蛋白质分子的游离酸性残基发生中和反应形成MRB,电泳管阴极端逐渐呈现红色。随着电泳的进行,阴极端红色区域逐渐变宽,即MRB逐渐移向阳极。通过相机拍摄的照片记录不同时间内MRB的移动距离。电泳时间持续10～20 min。每种豆浆的标准曲线是通过记录一系列蛋白质质量浓度(2.0～14.0 g/L)的豆浆在不同时间内移动的距离(D),根据公式(1)计算VMRB得到的。未知豆浆的蛋白质质量浓度(C)可以通过相应的标准曲线拟合方程计算得到。每个实验重复3次,VMRB取平均值。

2 结果与讨论
2.1 影响MRBT法测定豆浆中蛋白质的因素

用MRBT法测定牛奶中的蛋白质时,影响MRB移动的因素有电场强度、酸或碱浓度和电极液离子强度等[ 12 ]。本文研究了这些因素对豆浆中蛋白质所形成的MRB移动的影响。如图2a所示,电场强度范围为500～2000 V/m时,MRB移动速度基本与外加电场成正比;但当电场强度大于 2000 V/m时,MRB移动速度与电场之间的线性关系较差,而且当电场强度较大时,焦耳热对实验的影响很大;当电场强度过小时,界面移动太慢。如图2b所示,当NaOH浓度为0.005 mol/L 时,界面移动速度很慢;随着NaOH浓度增大,界面移动速度变快,但当NaOH浓度达到0.02 mol/L 时,界面移动速度随着浓度变化增大的幅度不大。如图2c所示,当离子强度为0.1 mol/L 或0.15 mol/L 时,界面移动速度比其它条件下移动速度快;但当离子强度为0.15 mol/L 甚至更大时,由于焦耳热、电流不稳定等因素的影响,界面移动速度变得不稳定。综合考虑,本实验中阴极液、阳极液和PAG中离子强度选择0.1 mol/L。

图 2 (a)电场强度(E)、(b)NaOH浓度和(c)背景电解溶液离子强度对界面移动的影响 Fig. 2 Influences of (a) electric field strength (E), (b) concentration of sodium hydroxide in catholyte and (c) ionic strength of background electrolyte on boundary motion
2.2 豆浆中蛋白质总浓度与VMRB的关系

为验证方法的可行性,选取4种豆浆进行测定。图3为蛋白质质量浓度为14 g/L 的4种豆浆中蛋白质和OH-形成的MRB在不同时间(t)移动的距离(D)。从图3中可以看到3 min时界面已经比较清楚,随着时间的增加,界面移动的距离也在逐渐增加。4种样品的D与t之间的线性拟合方程为:宝粒来,D宝=-0.207+0.263t,相关系数R=0.998;有机农庄,D有=-0.159+0.243t, R=0.998;禾煜,D禾=-0.066+0.202t, R=0.997;盛龙,D盛=-0.227+0.261t, R=0.998。结果表明D与t之间存在良好的线性关系。

图 3 由0.02 mol/L NaOH分别和总蛋白质质量浓度为14.0 g/L 的4种豆浆样品(宝粒来、有机农庄、禾煜、盛龙)形成的MRB及其对应的界面移动距离(D)和电泳时间(t)之间的关系 Fig. 3 MRB created with 0.02 mol/L NaOH and protein in soy samples of Bao Li Lai, You Ji Nong Zhuang, He Yu and Sheng Long with 14.0 g/L total protein and corresponding linear relationship between boundary motion distance (D) and run time (t)

为了进一步探究VMRB和豆浆中蛋白质浓度之间的关系,我们考察了不同蛋白质浓度的豆浆样品的MRB。图4为11 min时不同蛋白质浓度的豆浆样品的MRB所处位置。VMRB可以通过公式(1)计算得到。4种豆浆对应的VMRB与其中蛋白质浓度之间的线性拟合方程为:宝粒来,V宝=4.859-0.043C宝,R=0.975;有机农庄,V有=4.953-0.069C有,R=0.984;禾煜,V禾=4.493-0.070C禾,R=0.989;盛龙,V盛=4.725-0.033C盛,R=0.984;线性范围为2.0～14.0 g/L。VMRB与豆浆中的蛋白质浓度之间的线性关系比图3中界面移动距离与电泳时间的线性关系差,原因可能是MRBT法测定豆浆中的蛋白质浓度时,影响MRB移动的因素很多。对于未知蛋白质浓度的同种豆浆样品,可通过电泳滴定得到其VMRB,代入相应的线性方程即可得到其中的蛋白质浓度。

图 4 不同蛋白质浓度的4种豆浆(宝粒来、有机农庄、禾煜、盛龙)在11 min时的MRB移动距离及其界面移动速度(VMRB)与蛋白质质量浓度之间的线性关系 Fig. 4 MRB displacement distances of Bao Li Lai, You Ji Nong Zhuang, He Yu and Sheng Long with different protein concentrations at 11 min and corresponding linear relationship between VMRB and protein content
2.3 选择性考察

为了考察MRBT法的选择性,在14.0 g/L 豆浆中分别添加了不同质量浓度(0.1和1.0 g/L)的三聚氰胺或尿素,采用MRBT法与凯氏定氮法测定豆浆总蛋白质浓度，并对测定结果进行对比。从图5可以看出,用MRBT法检测添加了三聚氰胺和尿素后豆浆中的总蛋白质,测得的蛋白质质量浓度与空白对照组(未添加三聚氰胺或尿素)相比没有明显的差异;而用凯氏定氮法进行相同的测定，添加三聚氰胺或尿素后测得豆浆中的蛋白质质量浓度明显高于空白对照组,尤其是当加入量为1.0 g/L 时,差异更加明显。这些结果说明非蛋白质氮的添加对MRBT法的测定结果基本没有影响,原因是MRB由蛋白质上的酸性残基和OH-形成,而加入的非蛋白质氮不会和OH-反应,也就不会影响VMRB,因此基本上不会影响MRBT法的检测。

图 5 MRBT法和凯氏定氮(Kjeldahl)法检测添加非蛋白质氮(non-protein nitrogen, NPN)豆浆样品(有机农庄)的对比 Fig. 5 Comparison of MRBT and Kjeldahl methods in the determination of protein content of soy sample (You Ji Nong Zhuang) adulterated with non-protein nitrogen (NPN)
2.4 两种方法测定结果的关系

将MRBT法检测的一系列未知浓度豆浆的结果和凯氏定氮法进行了对比,结果基本一致,其拟合方程为CMRBT=-0.059+1.003CKjeldahl (R=0.99)。对两种方法测得的结果进行了配对t检验,t值为0.125,小于临界值t0.05, 3(3.182),说明了两种方法的检测结果在95%置信区间内没有显著性差异。以凯氏定氮法测得的豆浆中的蛋白质浓度值为标准值,将MRBT法的测得结果与其相比,其比值为97.41% ～99.91%。

2.5 方法学验证

在MRBT装置中,操作平台上可分辨的最小尺度为1 mm[ 11, 12 ]。因此,样品不断被稀释后,在相同时间内MRB移动的距离与空白对照(不含任何样品的凝胶)的界面移动的距离之差小于1 mm时的蛋白质浓度,被定义为MRBT的检出限(LOD)。根据此定义,MRBT法检测豆浆蛋白质的检出限为0.05 g/L,而凯氏定氮法的检出限为0.2 g/L[ 1 ]。由此可以看出,MRBT法的灵敏度好于凯氏定氮法。我们还对MRB在5～11 min内移动距离的日内和日间相对标准偏差(RSD)进行了分析。用14.0 g/L 的有机农庄豆浆在同一日内重复3次实验(时间间隔为2 h),计算得到日内RSD小于1.90% 。连续3日内利用14.0 g/L 的有机农庄豆浆重复3次实验,通过计算得到日间RSD小于4.39% 。

2.6 MRBT法测定牛奶和豆浆中蛋白质的比较

通过对比分析,MRBT法测定牛奶和豆浆中的蛋白质具有以下类似之处。第一,配对t检验在95%的置信区间内MRBT分别测定牛奶和豆浆中的蛋白质含量结果与凯氏定氮法相比均无显著性差异[ 12 ]。第二,MRBT法测定牛奶和豆浆中的蛋白质含量所需时间相近,为10 min左右[ 12 ]。第三,三聚氰胺等非蛋白质氮的添加,对MRBT法测定牛奶中的蛋白质和豆浆中的蛋白质影响都很小[ 12 ]。

但是,MRBT法测定牛奶和豆浆中的蛋白质也具有以下明显的区别。第一,总蛋白质浓度相同时,豆浆中的蛋白质所形成的MRB的移动速度与牛奶中的蛋白质所形成的MRB的移动速度差别较大,例如,蛋白质含量为10.0 g/L 的贝因美奶粉所形成的MRB移动速度为3.0×10-5 m/s[ 12 ],而蛋白质含量为10.0 g/L 的有机农庄豆浆所形成的MRB移动速度为4.2×10-5 m/s。造成这种差异的原因是:牛奶中的蛋白质主要为乳清蛋白和酪蛋白,占牛奶蛋白质的80%[ 13 ];而豆浆中的蛋白质主要为球蛋白,占80% ～90% ,还有小部分乳清蛋白;由于牛奶和豆浆中的蛋白质在组成上有较大的差别,根据MRBT原理它们所形成的界面的移动速度也会有较大的差别。第二,MRBT测定豆浆中蛋白质的线性范围为2.0～14.0 g/L,比测定牛奶中蛋白质的线性范围(5.0～20.0 g/L)略窄[ 12 ]。第三,MRBT法测定豆浆中蛋白质浓度的线性关系(见图4)与测定牛奶中蛋白质浓度的线性关系(见文献[ 12 ]中的图6)存在明显的差异。造成这种差异的原因仍不十分清楚,可能与各种样本所含的蛋白质的种类和浓度不同有关。

3 结论

本文利用MRBT法测定了豆浆中的总蛋白质含量。MRB是由阴极液中的OH-和固定在高交联度的PAG中的豆浆蛋白质分子形成。根据界面移动速度与蛋白质浓度线性关系建立的标准曲线计算未知蛋白质浓度样品,测定结果与凯氏定氮相比无明显差异。该方法简单、直观、分析速度快,而且在检测过程中受非蛋白质氮的影响较小,是一种较好的检测豆浆中总蛋白质含量的方法。

参考文献
[1]Thompson M, Owen L, Wilkinson K, et al. Analyst, 2002, 127(12): 1666  
[2]Moore J C, DeVries J W, Lipp M, et al. Comper Rev Food Sci Food Saf, 2010, 9(4): 330  
[3]Lam C W, Lan L, Che X, et al. Clin Chim Acta, 2009, 402(1): 150
[4]Trivedi U, Lakshminarayana D, Kothari I, et al. Sensor Actuator B: Chem, 2009, 140(1): 260  
[5] GB/T 22106-2008
[6]Deman J. Anal Chem, 1970, 42(3): 321  
[7]Deman J. Anal Chem, 1970, 42(14): 1699  
[8]Cao C X. J Chromatogr A, 1998, 813(1): 153  
[9]Cao C X, Fan L Y, Zhang W. Analyst, 2008, 133(9): 1139  
[10]Yang Q, Fan L Y, Huang S S, et al. Electrophoresis, 2011, 32(9): 1015  
[11]Wang H Y, Yang Q, Dong J Y, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry (王后禹, 杨清, 董靖宇, 等. 分析化学), 2012, 40(6): 968
[12]Guo C Y, Wang H Y, Liu X P, et al. Electrophoresis, DOI: 10.1002/elps.201300007
[13]McGoverin C M, Clark A S S, Holroyd S E, et al. Anal Chim Acta, 2010, 673(1): 26  
[14]Pace C N, Grimsley G R, Scholtz J M. J Biol Chem, 2009, 284(20): 13285  
[15]Duso A B, Chen D D Y. Anal Chem, 2002, 74(13): 2938  
[16]Huang T, Wu X Z, Pawliszyn J. Anal Chem, 2000, 72(19): 4758