色谱  2013, Vol. 31 Issue (10): 927-933   PDF (1000KB)    
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应万涛
酶切过程中肽段过烷基化对蛋白质定性和定量分析的影响
王继峰1,2, 赵新元1,2, 赵焱2, 马成2, 钟儒刚1, 钱小红1,2, 应万涛2     
1. 北京工业大学生命科学与生物工程学院, 北京 100022;
2. 蛋白质组学国家重点实验室, 北京蛋白质组研究中心, 北京放射医学研究所, 北京 102206
收稿日期：2013-04-23
基金项目：国家重点基础研究"973"项目(2012CB910301);国家高技术研究发展计划项目(2012AA020201);国家自然科学基金项目(31100591).
通讯作者：应万涛.E-mail:proteomics@126.com.
摘要：蛋白质的还原-烷基化是蛋白质酶切中的重要步骤,常用的烷基化试剂是碘乙酰胺(IAA),但是IAA除了和半胱氨酸发生反应,也可能和其他多种氨基酸发生副反应。我们模拟常规的酶切条件,系统地研究了蛋白质真实酶切时所有酶切肽段发生烷基化的情况。结果表明,多种氨基酸可以发生烷基化,其趋势为:半胱氨酸>肽段N端氨基酸>天冬氨酸>谷氨酸>组氨酸>天冬酰胺>赖氨酸>酪氨酸,同时也发现同一肽段上的氨基酸烷基化具有排他性和聚集性。根据定性结果,采用质谱多反应监测(MRM)技术对多个肽段进行了定量分析,评估了过烷基化对蛋白质定量分析的影响。该研究结果表明,过量的烷基化修饰对蛋白质的定性与定量分析都可能产生较大影响。在蛋白质组学研究的样本处理流程中,应避免样本的过烷基化。
关键词： 液相色谱     质谱     多反应监测     蛋白质组学     烷基化     碘乙酰胺    
Influence of overalkylation in enzymatic digestion on the qualitative and quantitative analysis of proteins
WANG Jifeng1,2, ZHAO Xinyuan1,2, ZHAO Yan2, MA Cheng2, ZHONG Rugang1, QIAN Xiaohong1,2, YING Wantao2     
1. College of Life Science and Bio-engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100022, China;
2. State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 102206, China
Received: 2013-04-23
Abstract: Reduction and alkylation with iodoacetamide (IAA) of the disulfide bridges in proteins are important procedures used in protein digestion. But the alkylation with IAA takes place not only on cysteine residues but also on other amino acid residues. Here we conducted a systematic study of all alkylated peptides under the usual protein digestion conditions. It showed that the potentials for alkylation reaction of different amino acid residues were cysteine>N-terminal amino acid>aspartic acid>glutamic acid>histidine>asparagine>lysine>tyrosine. Furthermore, we found that the alkylation reaction happened either exclusively or cooperatively among different amino acid residues in the same peptide. Based on the qualitative results on overalkylation at several peptides, the targeted multiple reaction monitoring (MRM) technique was used to evaluate the effect of overalkylation on quantitative protein analysis. The results showed that overalkylation has large effect on the qualitative and quantitative analysis of proteins and should be avoided in enzymatic digestion.
Key words: liquid chromatography (LC)     mass spectrometry (MS)     multiple reaction monitoring (MRM)     proteomics     alkylation     iodoacetamide    

近几年蛋白质组学迅猛发展,逐步渗入到生命科学的各个领域,并且由大规模的定性分析,向高通量、目标化、准确的定量分析发展。在常见的“自下而上”(bottom-up)的蛋白质组分析流程中,一个必须步骤是对蛋白质进行酶切处理,酶切的效果影响最终的鉴定结果和定量准确性。而酶切之前通常要进行蛋白质变性:先用尿素和十二烷基硫酸钠(SDS)等蛋白质变性剂破坏维系蛋白质三维结构的疏水相互作用和氢键等作用力；再加入二硫苏糖醇(DTT)或三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)等作为还原剂,打开二硫键；并加入碘乙酰胺(IAA)使还原状态的巯基发生烷基化,防止已还原的巯基重新形成二硫键,从而使蛋白质充分变性,提高酶切效率[ 1 ]。

已有大量文献[ 2, 3, 4, 5 ]对酶切的各个环节和不同的技术路线进行了优化和比较。但多数酶切方法的考察关注重点是各种变性剂和变性方法的比较[ 6 ]、微波辅助酶切[ 7 ]、多酶酶切和固定化酶技术的应用[ 8, 9 ]等,对于蛋白质变性后还原和烷基化条件考察的较少。

对于复杂样品,其二硫键数量无法准确评估,常根据经验加入适量的DTT和IAA,如Michael等[ 10 ]认为处理血清蛋白质,只需加入终浓度5 mmol/L 的DTT和10 mmol/L 的IAA即可实现充分的还原-烷基化。但在实际操作中,为了充分打开蛋白质二硫键,通常先加入过量的DTT,然后再加入过量的IAA封闭巯基以及中和过量的DTT。此时如果不按照化学计量比例再次补加DTT中和过量的IAA,将会导致随后的整个酶切过程中存在IAA。而IAA作为一种较强的烷基化试剂,不但能使巯基发生S-烷基化,也可能使蛋白质的羧基端发生O-烷基化[ 11 ],此外,Met、Lys、Asp、Glu等氨基酸以及肽段的N端氨基酸也可以发生N-烷基化[ 12 ]。但这些实验中,使用的是有限的(3个或4个)合成肽段,使用的条件也相对极端,如过高的温度和较长的反应时间,而且每篇报道关注的只是部分可能发生烷基化的氨基酸。没有在实际的酶切条件下准确地考察过量IAA的影响。

本研究系统地对酶切过程中的过烷基化现象进行了定性和定量探讨。在本研究中,选取了蛋白质组学研究常用的标准蛋白质牛血清白蛋白(BSA)作为研究对象,在常用的酶切条件下,比较了适量和过量的IAA对酶切结果的影响。除了定性确认可发生烷基化修饰的氨基酸残基外,还利用质谱多反应监测(MRM)技术,对发生烷基化的肽段进行了定量分析。



1 实验部分
1.1 仪器与试剂

毛细管高效液相色谱-电喷雾-线性离子阱-傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(LTQ-FT,美国Thermo Fisher公司);毛细管高效液相色谱-电喷雾-三级四极杆-离子阱混合型质谱仪(QTRAP 5500,美国Applied Biosystems公司);安捷伦1100毛细管色谱系统(美国Agilent公司); Eksigent NanoLC-2D毛细管色谱系统(美国Eksigent公司)。

BSA(纯度＞97% ,美国Sigma公司);胰蛋白酶(测序级,美国Promega公司); IAA和DTT(美国Bio Rad公司);甲酸(纯度为98%，美国Sigma公司);乙腈(色谱纯,美国Sigma公司);水(色谱纯,美国Thermo Fisher公司)。

1.2 还原-烷基化与酶切方法

取1 g/L BSA(50 mmol/L 碳酸氢铵溶液,pH 8.0),于95 ℃金属浴中变性5 min。分装成4份,每份100 μ L,命名为1～4号样品。1号样品直接加入2 μ g的胰蛋白酶(胰蛋白酶与BSA的质量比为1 ∶ 50); 2号样品加入DTT至终浓度5 mmol/L,于56 ℃水浴30 min,再加入IAA至终浓度10 mmol/L,室温避光30 min后,加入2 μ g的胰蛋白酶;3号样品加入DTT至终浓度10 mmol/L,于56 ℃水浴30 min,再加入IAA至终浓度40 mmol/L,室温避光30 min后,补加DTT至终浓度为10 mmol/L,振荡混匀10 min后,加入2 μ g的胰蛋白酶;4号样品反应条件同2号,但DTT终浓度为10 mmol/L, IAA终浓度为40 mmol/L。1～4号样品加入胰蛋白酶后,37 ℃水浴,12 h酶切完成后冻存,质谱分析前用流动相A液稀释上样。定性分析(使用仪器为LTQ-FT)上样量为1 pmol,定量分析(使用仪器为QTRAP 5500)上样量为200 fmol。

1.3 反相毛细管液相色谱条件

定性分析:Agilent 1100毛细管液相色谱系统,所用毛细管色谱柱为自填C18反相柱(100 mm×75 μ m,填料为GEAgel, SP-300-ODS-AP, 5 μ m,深圳欧亚科技发展有限公司);色谱洗脱采用二元泵高压混合的梯度洗脱方式,洗脱组分经过ESI离子源直接进入质谱进行分析。流动相由流动相A(0.1% FA+98%水+2%乙腈)和流动相B(0.1% FA+80%乙腈+20%水)构成。梯度洗脱条件:0～1 min, 5%B; 1～41 min, 5%B～50%B; 41～51 min; 50%B～100%B; 51～61 min, 100%B; 61～62 min, 100%B～5%B, 62～72 min, 5%B。流速为300 nL/min,进样体积为20 μ L。

定量分析:Eksigent 2D液相色谱系统。在线脱盐柱为自填C18反相柱(20 mm×100 μ m,填料GEAgel, SP-300-ODS-AP, 5 μ m,深圳欧亚科技发展有限公司); C18填料自制毛细管分析柱,同“定性分析”。流动相和洗脱条件同“定性分析”。流速为380 nL/min;进样体积为5 μ L。

1.4 质谱采集条件

LTQ-FT质谱分析采用数据依赖的扫描模式(data dependent MS/MS scan)。一级全扫描在FT-ICR中进行,扫描范围为m/z 400～1500。一级质谱中最强的10个离子进入离子阱进行二级质谱分析。二级信号记录采用centroid模式,采用动态排除功能(dynamic exclusion),设置排除时间为0.5 min。归一化碰撞能量为35% 。

QTRAP 5500参数设置如下:喷雾电压为 2300 V, Gas 1(氮气)为30 Pa,去簇电压为80 V。第一级四极杆和第三级四极杆扫描分辨率设置为“unit”。选择目标离子传输窗口为0.7 Da。每对离子对处理时间为15 ms。

1.5 质谱数据处理

来源于LTQ-FT的质谱数据使用Sequest(版本为3.2)和Maxquant(版本为1.3.0.5)软件搜库进行定性分析。两种搜索引擎均以BSA理论序列为目标数据库。Sequest搜库时分别设置最大漏切位点为0和2,半胱氨酸烷基化为固定修饰,分子质量增加57.02 Da,甲硫氨酸氧化为可变修饰,分子质量增加15.99 Da; Maxquant搜库时设置最大漏切位点为2个,在AndromedaConfig中添加甲硫氨酸氧化和赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、肽段N端氨基酸的烷基化为可变修饰,分子质量增加57.02 Da(甲硫氨酸为58.02 Da)。为了考察半胱氨酸的实际烷基化程度,半胱氨酸的烷基化也设置为烷基化可变修饰。来源于QTRAP 5500的质谱数据导入到MultiQuant(版本为2.0.2)中进行定量分析。

2 结果与讨论
2.1 不同还原-烷基化条件对酶切效率的影响

为避免酶切后样品的脱盐对定量结果的影响,本实验没有使用尿素或SDS等变性剂,而是采用加热的方法使BSA变性。实际上,我们曾比较了不同变性剂对BSA酶切的影响(数据未列出),如尿素、Rapigest和离子液体(BMIM BF4)[ 13 ],结果表明是否加入这些变性剂对单一蛋白质的酶切效果没有显著差别。

在本实验中,4种酶切条件的Sequest搜库结果如图1所示。1号样品与2～4号样品相比,由于其没有进行还原-烷基化,因此酶切效率明显偏低,表明蛋白质二硫键的还原-烷基化可有效提高BSA的酶切效率,其对于酶切的重要性高于变性。观察质谱的总离子流图(图略)也发现,1号样品所检测到的峰数目明显小于其他样品。2号样品使用低浓度的DTT和IAA(5 mmol/L 和10 mmol/L),二者浓度只有3号样品和4号样品的二分之一,但也可以实现有效的酶解。3号样品经过常用的还原-烷基化流程,可以看出无论是3号样品中IAA过量后补加DTT(DTT ∶ IAA ∶ DTT为1 ∶ 4 ∶ 1),还是2号样品中严格按1 ∶ 2加入DTT和IAA,都能实现有效酶解,而且定性鉴定表明二种处理都能保证所有的半胱氨酸烷基化,且不会造成过烷基化现象。4号样品中IAA过量,其酶切效果略低于2号和3号样品,而且后续的定性鉴定表明多种氨基酸发生烷基化修饰。以上结果表明,对于BSA这种多二硫键的蛋白质,为了达到更高的酶切效率,必须在酶切前进行恰当的还原-烷基化处理。

图 1 不同还原-烷基化条件对蛋白质序列覆盖率的影响 Fig. 1 Effect of different reduction and alkylation conditions on protein sequence coverage
2.2 烷基化肽段的质谱鉴定

在已报道的肽段过烷基化修饰的研究中,使用的目标肽段是有限的几个合成肽段。如Boja等[ 12 ]使用4个标准肽段,同时鉴定到肌动蛋白(actin)的3个肽段发生过烷基化；Yang等[ 11 ]也仅使用VAAF、glutathione(GSSG)、angiotensin I(DRVYIHPFHL)、SLIGRL这4个肽段进行烷基化研究。以上工作中对不同氨基酸烷基化的规律讨论较少,而且使用的是简单的肽段纯品,质谱谱图数量有限且相对简单,质谱谱图解析也是以手动为主,不适合实际样本中复杂肽段的烷基化鉴定。在本实验中,我们引入Maxquant软件作为肽段烷基化修饰的鉴定软件。

Maxquant搜库后3号样品和4号样品共同鉴定的肽段为49条,如表1所示。在3号样品中,几乎所有的半胱氨酸都发生了烷基化,其他氨基酸没有发现烷基化。4号样品中,除所有半胱氨酸发生烷基化外,其他氨基酸也检测到大量的烷基化;除了甲硫氨酸和精氨酸以外,其他文献报道的能够发生烷基化的氨基酸都被检测到;只有2条肽段没有烷基化,其余47条肽段都部分或全部发生了烷基化;49条肽段中带有半胱氨酸的肽段为30条,所有的半胱氨酸都发生了烷基化,其中22条在其他位点也发生了烷基化;在不含半胱氨酸的19条肽段中,17条发生了非特异性烷基化。这些数据表明,无论是3号还是4号样品的处理方法都能够使大部分的半胱氨酸烷基化,只有个别含多个半胱氨酸的肽段在3号样品中没有完全烷基化,如15号肽段和44号肽段含有2个半胱氨酸,既检测到2个半胱氨酸都发生烷基化的肽段,也检测到1个半胱氨酸发生烷基化的肽段。

表 1 3号和4号样品共有的肽段烷基化修饰 Table 1 Overlap of alkylated peptides in sample 3# and sample 4#
2.3 不同氨基酸发生烷基化的趋势

为了了解不同氨基酸发生烷基化的情况,我们统计了表1中3号和4号样品发生烷基化的氨基酸的数目占该氨基酸总数的比例。如图2所示,检测到的半胱氨酸全部发生烷基化,显著高于其他位点,所以我们认为在本实验条件下,半胱氨酸的烷基化具有优先性。其次,容易发生烷基化的是肽段N端氨基酸,为46% ；天冬氨酸和谷氨酸的O-烷基化也较容易发生,比例为37%和35% ；而碱性氨基酸发生烷基化的比例小于酸性氨基酸。总体上,烷基化比例从大到小排列为:半胱氨酸＞肽段N端氨基酸＞天冬氨酸＞谷氨酸＞组氨酸＞天冬酰胺＞赖氨酸＞酪氨酸。没有检测到精氨酸残基发生烷基化,可能是由于精氨酸具有较高的pKa值(12.4),而本实验中所用50 mmol/L 碳酸氢铵溶液的pH为8.0,导致精氨酸的胍基处于富质子状态,不利于精氨酸形成亲核基团与IAA反应。同时,我们也只检测到少量的酪氨酸发生O-烷基化,同样是由于其在碱性溶液中亲核性较弱,不利于与IAA反应。本实验中并没有检测到甲硫氨酸的烷基化,在所有鉴定到的肽段中,只有3个肽段含有单个甲硫氨酸,结果显示这3个甲硫氨酸都发生了氧化,没有发生烷基化。其原因可能是在碱性反应条件下,甲硫氨酸的氧化更易于发生,阻碍其发生烷基化;或者也有可能在碱性条件下甲硫氨酸发生烷基化后,进一步发生霍夫曼消除反应(Hofmann elimination reaction)[ 14 ],导致最终结果不是加58.02 Da,而是减少48 Da,所以没有检测到。由于本实验中的样品含有的甲硫氨酸数目过少,结果的统计意义不强,需在一个更大的数据集中做进一步的确认。

图 2 各种氨基酸发生烷基化修饰的比例 Fig. 2 Percentages of alkylation for different amino acids AA: amino acid.
2.4 氨基酸烷基化具有排他性和聚集性

进一步详细的分析表明,同一肽段中不同氨基酸的烷基化会相互影响,有两种趋势,即排他性和聚集性。在4号样品中,对每个肽段发生烷基化的氨基酸的种类进行分类,如图3所示,对于天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸,其发生烷基化后具有排他性,即这些位点发生烷基化后会强烈抑制该肽段的其他位点发生烷基化,所以表现为这些肽段只具有其中一种氨基酸的修饰;如包含半胱氨酸的肽段共有35条,其中34条只发生半胱氨酸的单一修饰,只有1条肽段(GACLLPK)除了发生半胱氨酸烷基化外还在N端和末端K发生进一步的烷基化。同样,对于含有天冬氨酸的肽段,只发生单一的天冬氨酸烷基化的肽段的比例为93.8%(15/16);对于含有谷氨酸的肽段,该比例为75%(12/16)。

图 3 氨基酸烷基化的排他性和聚集性 Fig. 3 Exclusivity and cooperativity of alkylated amino acids n=1: the single type of the alkylated amino acids in peptides; n≥2: the multiple types of the alkylated amino acids in peptides.

本实验共鉴定到21条多烷基化肽段。其中主要是发生两种氨基酸烷基化,比例为52.4%(11/21)。21条肽段中,N端氨基酸全部发生烷基化；其次为赖氨酸,所占比例为61.9%(13/21)；再次为组氨酸和天冬酰胺,所占比例分别为28.6%(6/21)和19%(4/21)；酪氨酸和谷氨酸为19%(4/21)；半胱氨酸和天冬氨酸最少，各一例,为4.8%(1/21)。因此,我们推测发生多位点烷基化时的过程如下：首先,N端的氨基酸最容易发生烷基化,接着促使同一肽段上的一个或多个碱性氨基酸发生N-烷基化,其中只有少部分同时发生其他类型的烷基化,如O-烷基化；当然二者也可能互为条件,有协同烷基化效应,即一个肽段如果含有多个碱性氨基酸(N端氨基酸、赖氨酸、组氨酸、天冬酰胺),那么该肽段趋向于在这些位点发生多位点N-烷基化。先前的报道中,Boja等[ 12 ]鉴定到angiotensin I(DRVYIHPFHL)可在N端氨基酸和2个组氨酸(H)上发生三烷基化,同样Woods等[ 15 ]在胶内酶解中鉴定到2个肽段发生多烷基化,分别是NTDGSTDYGILQINSR(在N端氨基酸和靠近C端的天冬酰胺(N)上发生烷基化)和FESNFNTQATNR(在N端氨基酸和靠近C端的天冬酰胺(N)上发生烷基化),这些报道与我们提出的N端氨基酸和碱性氨基酸的协同聚集模式一致。

2.5 烷基化对鉴定结果的影响

图1显示了不同的样品处理方式导致鉴定结果的不同,但是如果发生了过烷基化,那么不同的搜库条件对鉴定结果又有何影响?对于4号样品,用Maxquant搜库,设置两种搜库条件：其一,只设常规的修饰,即甲硫氨酸的氧化为可变修饰,半胱氨酸的烷基化为固定修饰;其二,可变修饰加入上文提到的各种可能的烷基化修饰。最大漏切位点都设为2个。结果显示,二者得到的BSA的序列覆盖率相差无几,前者为78.3% ,后者为78.6% ；但是后者的二级谱图利用率高于前者,前者为13.33% ,后者为17.72% 。进一步分析,前者鉴定到56条肽段,后者鉴定到114条肽段,后者完全覆盖前者；但后者多鉴定到的58条肽段都是前者的过烷基化产物,所以这58条肽段对BSA的序列覆盖率几乎没有贡献,最终导致二者的序列覆盖率相差无几；这一点也表明,虽然众多的肽段发生了过烷基化,但是发生过烷基化的比例没有达到百分之百,这些肽段虽然在数量(即峰面积和强度)上有所降低,但是对最终的序列覆盖率影响不大。不过需要指出的是本实验使用的是相对简单的标准蛋白质,在更复杂的实际样本中,定性的鉴定结果可能受到影响。原因一是对于复杂样品中的低丰度蛋白质,往往只能鉴定到1～2个肽段,如果是蛋白质含量动态范围极大的样品,如血清,那么其鉴定结果中单肽段的蛋白质更可高达30%[ 16 ]。由于这些肽段的峰强度相对较弱,如果再发生过烷基化修饰,那么其未修饰肽段的质谱强度进一步降低,可能导致鉴定不到该肽段。所以如果发生过烷基化的情况,尤其是类似血清这样蛋白质含量动态范围极大的复杂样品,建议搜库条件中添加各种可能的烷基化修饰位点为可变修饰。原因二是过烷基化会导致样品复杂性的增加,如本实验中3号样品中鉴定到的肽段为52条,但是4号样品中鉴定到108条肽段,过烷基化导致样品的复杂性增加一倍；如Mann等[ 17 ]在比较传统细胞培养稳定同位素氨基酸标记(stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC)技术和超级SILAC(super SILAC)技术时指出样品复杂性的增加会导致蛋白质鉴定数目的减少,原因就是对同一肽段的重复鉴定。所以我们推测在复杂样本中,过烷基化可能会对蛋白质的定性鉴定结果产生负面影响。

但另一方面,肽段的烷基化会增加其在质谱中的响应信号,已有多篇文献[ 18, 19 ]报道在肽段的半胱氨酸或N端氨基加上不同长度的烷基链,以增强其在电喷雾质谱中的响应。在本实验条件下,在二级质谱图中,我们观察到某些肽段发生烷基化后,其b系离子会显著增强。如肽段HLVDEPQNLIK在第四位的D发生烷基化,比较b系和y系离子的相对强度,发现除b2、b3外,所有的b系离子的响应都得到增强,b4和b5一跃成为最强的子离子；因为从b4开始,之后所有的b系离子都增加了烷基化基团,所以表明烷基化明显增强了b系离子的质谱响应信号,而对于y系离子没有显著增强。Yang等[ 11 ]提出了相似的结论,他们认为肽段N端氨基酸烷基化会导致y系子离子的信号降低,甚至消失,当然这也使它们谱图中的b系离子相对强度增高。但是,更大范围地观察发生烷基化肽段的二级质谱图,发现实际情况更加复杂,符合以上规律的肽段只是一部分,究其原因可能是肽段的组分不同对烷基化的响应不同，发生烷基化的氨基酸不同响应也不同及多位点发生烷基化有互作效应等,还有待于进一步探究。

2.6 肽段烷基化的定量分析

综上所述,肽段发生烷基化后,将以各种可能的方式影响着定性鉴定结果,而且一旦发生过烷基化,会直接影响蛋白质的定量结果。为准确评估过烷基化对定量结果的影响,我们从4号样品的鉴定列表中选取了只发生单一位点的过烷基化修饰的7个肽段,采用靶向MRM质谱技术,定量分析了其发生烷基化的比例。每个肽段的测定重复3次,定量结果见表2。在3号样品中,4个肽段没有检测到过烷基化部分,3个肽段检测到微量的过烷基化部分,最高的过烷基化比例为0.2% 。在4号样品中,所有肽段都检测到过烷基化,过烷基化肽段的峰面积高于3号样品中相应肽段峰面积2～3个数量级,比例为2.1% ～27.2% 。虽然烷基化可造成肽段质谱响应提高,但是IAA的烷基链短小,对肽段疏水性的增强有限,所以比值的高低也大致反映了各肽段烷基化的程度。从结果中可以看出不同的肽段发生烷基化的比例不同,最高为27.2% 。

表 2 部分烷基化肽段发生的比例(n=3) Table 2 Ratios of peak area of alkylated peptides to total peak area of the peptides(n=3)
3 结论

在蛋白质的酶切过程中,为了达到好的酶切效果,往往需要加入还原剂DTT和烷基化剂IAA来打开所有的二硫键,但是如果没有及时去除多余的IAA,将导致众多的肽段发生过烷基化。因此,我们以BSA为目标,在常用的酶切条件下,定性和定量分析了肽段的各种烷基化情况。在我们的实验中发现不同的氨基酸发生烷基化的比例不同,由大到小为半胱氨酸＞肽段N端氨基酸＞天冬氨酸＞谷氨酸＞组氨酸＞天冬酰胺＞赖氨酸＞酪氨酸,反映了不同氨基酸发生烷基化的难易程度。而且我们发现一条肽段上的氨基酸发生烷基化,会影响同一条肽段上的其他潜在位点的进一步烷基化,不同的氨基酸发生修饰的特性存在排他性和协同聚集性。

根据定性结果,采用MRM方法定量分析了7个肽段的烷基化水平,其中发生烷基化最高的比例为27.2% ,不同肽段的烷基化比例也反映了当发生过烷基化时,利用这些肽段做MRM绝对定量分析时可能产生的误差范围。鉴于IAA的过烷基化造成定性结果的复杂性和定量结果的误差,我们建议严格按照化学计量加入DTT和IAA,即二者最终物质的量比为1 ∶ 2,控制烷基化时间为30 min,并在烷基化后及时封闭残留IAA。

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