P/ACE System 5000型毛细管电泳仪、P/ACE System Laser Module 488激光发射器和P/ACE System 5000 station数据处理软件均购自美国Beckman公司。

聚环氧乙烷(PEO,分子质量为 300 000 Da)、丙烯酰胺(acrylamide)、 N,N′ -亚甲基双丙烯酰胺(bisacrylamide)、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(上海生工生物工程技术服务有限公司); γ -甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(MAPS, A Johson Matthey公司);三羟甲基氨基甲烷(Tris,上海山浦化工有限公司);乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、硼酸(天津化学试剂厂);异硫氰酸酯(FITC)(Sigma公司);以上试剂均为分析纯。组织蛋白质提取试剂盒(上海生工生物公司);系列分子质量蛋白质标志物:Protein Molecular Weight Marker (Broad) D532S (TaKaRa公司);二甲苯为化学纯; 苏木精染液、伊红染液、1%盐酸乙醇分化液由本实验室配制。

胃癌组织及癌旁正常组织样品取自兰州军区兰州总医院病理科,共40例80个样本。其中男28例、女12例,患者年龄43～71岁,平均年龄(59±2)岁。标本来自胃部切除术并经病理切片证实,其中高分化腺癌6例、中分化腺癌18例、低分化腺癌15例、胃溃疡癌变1例。HE染色按常规病理染色方法进行。

蛋白质吸附是影响毛细管分离蛋白质的难题之一。目前人们通常采用极端pH、添加剂、外加径向电场和聚合物涂层等几种方法来抑制蛋白质在管壁的吸附^{[ 10 ]}。本实验对毛细管管壁添加化学涂层,并采用pH 10的1×TBE(Tris-borate-EDTA)作为缓冲液以减少蛋白质对管壁的吸附。涂覆步骤按文献^{[ 11 ]},具体如下:取一段石英毛细管,用0.2 mol/L NaOH清洗1 h,再分别用水、甲醇、空气各冲洗15 min。用MAPS-甲醇(1 ∶ 1, v/v)混合物冲洗毛细管1 h,室温反应过夜。分别用甲醇、水、空气各冲洗毛细管15 min,再用3.4 g/L丙烯酰胺单体溶液冲洗毛细管1 h,室温反应4 h,用水冲洗20 min,即可使用。

取胃癌组织20 mg,充分剪碎,置于Eppendorf管中,用组织蛋白质提取试剂盒提取胃癌组织蛋白质,置于-20 ℃冰箱中保存备用。

将FITC溶于二甲基亚砜(DMSO)中制成1 g/L的溶液。将提取的蛋白质溶于0.5 mol/L 碳酸盐缓冲液(pH 9.0)中,缓慢加入FITC溶液,搅拌均匀。注意避光。

毛细管柱为37 cm×75 μ m,有效长度27 cm,使用前用水和l×TBE分别冲洗5 min,再用毛细管电泳仪压力系统自动填充筛分介质PEO溶液5 min。以l×TBE为缓冲液进行CE-LIF分离检测( λ _Ex=488 nm, λ _Em=520 nm),负极电动进样10 s,进样电压10 kV。用P/ACE System 5000 station数据处理软件采集数据。

用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(版本号:2004A)对获得的蛋白质电泳图谱进行比对。通过对迁移时间和峰面积进行自动匹配,计算相似度,研究胃癌组织及癌旁正常组织蛋白质的差异性。

用已优化的条件对40个胃癌组织和癌旁正常组织样品进行测定,在30 min内实现了对单一样品蛋白质的分离,获得电泳峰数目约40个。图2为一例中分化腺癌胃癌组织与癌旁正常组织毛细管电泳检测结果。在14 min至17 min期间,与癌旁正常组织相比，胃癌组织的蛋白质电泳峰数目增多,且响应值增大。提示胃癌组织中可能存在与癌症发生相关的特异蛋白质高表达。

图2

Fig. 2

图 2 (a)癌旁正常组织和(b)胃癌组织中蛋白质的毛细管电泳图 Fig. 2 Electropherograms of proteins from (a) normal tissue and (b) gastric cancer tissue

本研究中所选用样本的HE染色图见图3,包括正常组织(a)、高分化腺癌(b)、中分化腺癌(c)和低分化腺癌(d)。经HE染色和CE-LIF检测后,对40个样本组织学分型及蛋白质电泳峰数目进行统计,结果(表1)显示,不同组织学分型样品的电泳峰数目不同,与蛋白质表达差异有一定关系。

图3

Fig. 3

图 3 胃癌组织及癌旁正常组织切片的HE染色图 Fig. 3 Hematoxylin eosin (HE) staining images of sections of normal tissue and gastric cancer tissue a. normal tissue; b. well differentiated adenocarcinoma; c. moderately differentiated adenocarcinoma; d. poorly differentiated adenocarcinoma.

表 1 样本组织学分型及蛋白质峰数统计 Table 1 Statistical analysis of sample histological classification and electrophoresis peak numbers Histological classification Sample number Electrophoresis peak number Male Female Normal tissue Gastric cancer tissue Well differentiated adenocarcinoma 3 1 37 44* Moderately differentiated adenocarcinoma 10 8 35 39* Poorly differentiated adenocarcinoma 15 2 40 43* Malignant change of benign gastric ulcer 0 1 27 29 * P ＜0.05

表 1 样本组织学分型及蛋白质峰数统计 Table 1 Statistical analysis of sample histological classification and electrophoresis peak numbers

为更好地比较胃癌组织与癌旁正常组织蛋白质电泳峰的差异性,使用中药指纹图谱相似度评价软件进行数据分析。将胃癌组织与癌旁正常组织蛋白质电泳图谱数据按照软件要求导入,自动生成对照图谱(见图4),并获得相似度计算结果(见表2)。

图4

Fig. 4

图 4 毛细管电泳指纹图谱分析图 Fig. 4 Fingerprint analysis of electropherograms

表 2 癌旁正常组织、胃癌组织和生成的指纹图谱之间的相似度 Table 2 Similarities of electropherograms of normal tissue, gastric cancer tissue and fingerprint Electropherogram Normal tissue Gastric cancer tissue Fingerprint Normal tissue 1.000 0.802 0.952 Gastric cancer tissue 0.802 1.000 0.946 Fingerprint 0.952 0.946 1.000

表 2 癌旁正常组织、胃癌组织和生成的指纹图谱之间的相似度 Table 2 Similarities of electropherograms of normal tissue, gastric cancer tissue and fingerprint

胃癌组织及癌旁正常组织样品间出峰时间经自动匹配,排除迁移时间的微小差异,其峰面积RSD分别为4.77%和3.20% ,说明该方法具有良好的重现性。根据样品迁移时间和峰面积计算胃癌组织和癌旁正常组织指纹图谱的相似度均大于0.8,说明两者大多数蛋白质相吻合;但胃癌组织比癌旁正常组织的蛋白质峰多,电泳结果显示胃癌组织中可能有与癌症发生相关的特异蛋白质高表达,且大多数集中在小分子区域。差异蛋白质主要为分子质量在50 000～100 000 Da之间的小分子蛋白质,其中可能有与癌症发生相关的蛋白质,可作为肿瘤蛋白质标记物的潜在筛选对象,有进一步分离鉴定的研究价值。