Thermo Scientific MSQ质谱仪配大气压化学电离源(APCI); Dionex ICS-3000离子色谱仪配ASRS 300 4-mm抑制器、CSRS 300 4-mm抑制器、电导检测器(conductivity detector)、Dionex AS自动进样器;XW-80A涡旋混合器(上海医科大学仪器厂); H-2050R高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司); Milli-Q超纯水一体机(Millipore公司);乙腈、甲醇、正己烷(德国Merck公司); 6种糖醇标准品(纯度均大于99% , Dr. Ehrenstorfer公司);质量分数为50%的氢氧化钠溶液、100 mmol/L甲基磺酸(Dionex公司); C18填料(上海国药集团)、混合型离子交换填料(本实验室制备);筛板、10 mL聚丙乙烯注射器(北京瑞景泽佑公司)。

样品为全国口岸进出口的蜂蜜、糖果、咖啡、口香糖、果汁、味淋风、醋、饼干等,共计196份。

准确称取适量的6种糖醇标准品,用超纯水配制成1 g/L 的标准储备液,置于4 ℃冰箱中保存。用超纯水将6种糖醇储备液稀释成不同质量浓度的混合标准工作液。

在10 mL注射器的底部装入筛板,加入100 mg混合型离子交换填料,装筛板压紧;再装入100 mg C18填料,装筛板压紧。SPE柱在使用前进行活化处理。在负压条件下加5 mL甲醇于柱端,以3 mL/min 的流速过柱清洗杂质;加入50%(如无特殊说明均为体积比)的甲醇5 mL于柱端,以3 mL/min 的流速过柱。

饼干等含蛋白、油脂的样品:取0.1～1.0 g样品于50 mL离心管中,加25 mL水涡旋混合3 min,超声提取10 min。取5 mL上清液于10 mL离心管中,加5 mL正己烷涡旋混合;以 5000 r/min 离心10 min,去除正己烷层;下层取2 mL于另一离心管中,加3 mL乙腈涡旋;冷冻离心(5000 r/min, -15 ℃)15 min;取上清液1.5 mL于另一试管中,氮气吹干后加3.5 mL水涡旋复溶,过水相膜和SPE柱。滤液供IC-MS检测。

果汁、蜂蜜、味淋风等样品:取0.1～1.0 g样品于100 mL容量瓶中,加水定容,过水相膜和SPE柱,滤液供IC-MS检测。

其他固体样品:取0.1～1.0 g样品于研钵中,加少量水充分研磨后转移至100 mL容量瓶中,加水定容。取10 mL溶液离心(5000 r/min, -15 ℃)15 min,取5 mL上清液过水相膜和SPE柱,滤液供IC-MS检测。

具体的SPE净化步骤为：将待净化的样液转移至SPE柱上,以2 mL/min 的流速过柱。弃去最初的4 mL样液,收集最后的1 mL样液用于检测。

检测糖醇时所用的IC条件：CarboPar MA1分离柱(250 mm×4 mm, Dionex公司); CarboPar MA1保护柱(50 mm×4 mm, Dionex公司);四元梯度泵流速:0.50 mL/min(分离柱淋洗液);恒流泵流速:1.0 mL/min(为抑制器提供水源);淋洗液:90 mmol/L 氢氧化钠溶液(等度洗脱); CSRS 300 4-mm抑制器电流:139 mA;进样量:25.0 μ L。

评价混合离子交换填料去除阴离子的效果时所用条件：IonPac AS11-HC分离柱(250 mm×4 mm, Dionex公司);四元梯度泵流速:0.50 mL/min(分离柱淋洗液);恒流泵流速:1.0 mL/min(为抑制器提供水源);淋洗液:90 mmol/L 的氢氧化钠溶液;ASRS 300 4-mm抑制器电流:139 mA;进样量:25.0 μ L。

评价混合离子交换填料去除阳离子的效果时所用条件：IonPac CS12-12A分离柱(250 mm×4 mm, Dionex公司);四元梯度泵流速:0.50 mL/min (分离柱淋洗液);恒流泵流速:1.0 mL/min (为抑制器提供水源);淋洗液:100 mmol/L 的甲基磺酸溶液;CSRS 300 4-mm抑制器电流:30 mA;进样量:25.0 μ L。

检测糖醇和评价混合离子交换填料去除阴离子的效果时采用APCI^-离子化模式，评价其去除阳离子的效果时采用APCI⁺离子化模式;晕针温度450 ℃;雾化气为氮气(纯度为99.9% 、压力为379.2 kPa)。在此条件下，各糖醇的保留时间和特征离子见表1。

表 1 6种糖醇的保留时间和特征离子 Table 1 Retention times and monitored ions of the six alditols Compound Retention time/min Monitored ion (m/z) Erythritol 10.3 121.1 Xylitol 12.5 151.2 D-Sorbitol 19.3 181.2 D-Mannitol 24.3 181.2 Lactitol 32.9 343.3 Maltitol 57.3 343.3

表 1 6种糖醇的保留时间和特征离子 Table 1 Retention times and monitored ions of the six alditols

糖醇有非常好的水溶性,样品用纯水溶解后,其中的蛋白、油脂可用乙腈沉淀以及冷冻离心的方法分别去除。再过SPE柱可有效去除色素、有机酸、阳离子等杂质,从而取得良好的净化效果。

2.1.1 SPE柱去除阴离子杂质的效果

如图1所示，考察了C18和混合离子交换填料对有机酸等阴离子以及糖醇的吸附效果。选择了3种糖醇(赤藓糖醇、木糖醇、D-山梨糖醇)以及3种有机酸(乳酸、苹果酸、柠檬酸),以果汁为基质配成混合溶液。如不经过SPE柱净化,在等度洗脱条件下IonPac AS11-HC阴离子交换柱对糖醇的分离效果不好,3种糖醇几乎在同一时间(5.8 min)出峰,而3种有机酸出峰时间分别为10.6 min (乳酸)、17.2 min (苹果酸)和25.1 min (柠檬酸);经过SPE柱净化后,3种有机酸无响应信号,表明其已全部被吸附于SPE柱上,而糖醇的峰依然存在。这表明混合离子交换填料对糖醇的吸附能力较弱,而对阴离子保留效果比较好。

图1

Fig. 1

图 1 提取液经SPE柱净化(a)前、(b)后3种糖醇和3种有机酸的选择离子监控色谱图 Fig. 1 SIM chromatograms of the three alditols and the three organic acids in the extract (a) before and (b) after cleaned up by a SPE column

离子色谱采用NaOH溶液为淋洗液,随着其浓度的升高,6种糖醇的出峰时间均提前。以较高浓度的NaOH溶液为淋洗液,可缩短洗脱时间,但当淋洗液浓度上升到一定值时,ASRS 300 4-mm抑制器不能将淋洗液中的阳离子完全抑制掉而影响质谱寿命。因此,最终选择浓度为90 mmol/L 的NaOH溶液为淋洗液。尽管D-山梨糖醇和D-甘露糖醇、乳糖醇和麦芽糖醇为同分异构体,但90 mmol/L 的NaOH溶液等度洗脱能将其完全分离开。整个实验期间,柱压保持相对稳定,糖醇出峰时间也保持相对稳定。

分别对质谱的电喷雾离子(ESI)源和APCI源进行了测试。发现相同条件下,采用ESI源分析糖醇时,质谱没有相应的响应信号;而采用APCI源正离子模式分析时,质谱却有明显的信号。采用正离子模式可使糖醇质子化,以[M+H]⁺的形式存在。

质谱锥孔电压对糖醇的出峰灵敏度影响较大,分别考察20、30、40、50、60、70 V时对6种糖醇分析结果的影响,发现在锥孔电压为50 V时6种糖醇的峰面积最大,从而确定分析6种糖醇的最佳锥孔电压都为50 V。在以上优化条件下,得到6种糖醇的选择离子监测色谱图(见图3)。

图3

Fig. 3

图 3 6种糖醇标准混合溶液的选择离子监测色谱图 Fig. 3 SIM chromatograms of the mixed six alditols standard solution

在优化的实验条件下,用系列浓度的空白加标溶液进行线性关系的考察。以峰面积(y)为纵坐标,以糖醇质量浓度(x, mg/L)为横坐标进行线性回归;以S/N分别为3和10确定各糖醇在样品中的检出限(LOD)和定量限(LOQ),结果见表2。

表 2 6种糖醇的线性关系、LOD和LOQ Table 2 Linear relationships, LODs (S/N=3) and LOQs (S/N=10) of the six alditols Compound Linear range/(mg/L) Regression equation R2 LOD/(mg/kg) LOQ/(mg/kg) Erythritol 0.313 -20.00 y=4.63×103x-0.27×102 0.999 0.28 0.98 Xylitol 0.313 -20.00 y=5.86×103x-2.53×103 0.999 0.59 1.99 D-Sorbitol 0.313 -20.00 y=3.82×103x-2.00×103 0.997 0.71 2.24 D-Mannitol 0.625 -40.00 y=3.73×103x-5.67×103 0.996 1.74 5.92 Lactitol 3.125 -200.00 y=1.53×102x-0.40×102 0.999 4.14 13.56 Maltitol 3.125 -200.00 y=1.15×102x-1.25×102 0.999 4.03 13.21 y: peak area; x: mass concentration, mg/L.

表 2 6种糖醇的线性关系、LOD和LOQ Table 2 Linear relationships, LODs (S/N=3) and LOQs (S/N=10) of the six alditols

在实施检测结果质量控制时,主要对加标回收率和相对标准偏差进行了统计分析。由于各种糖醇的含量高低差异较大,同一种样品提取液的稀释倍数可能会相差几百倍。因此各种糖醇的加标量需要逐一测定,分类统计,具体结果见表3。

选择检测的样品时考虑了以下几个因素:(1)样品中本身就含有糖醇且进出口量比较大的品种(如蜂蜜、果汁等),主要研究这些天然产物中糖醇的含量,以及地域分布对其影响。(2)样品基质比较复杂。如香醋,其中的食盐(1.2% )、氨基酸(0.12% )、还原糖(3.1% )、总酸(5.8% )含量都比较高,特别是食盐含量高会对质谱信号产生很强的抑制作用,大大降低检测的灵敏度。而这些成分与糖醇皆为水溶性物质,选择香醋作为研究对象可充分考察样品前处理的效果。(3)产品中添加了糖醇的品种,如饼干、口香糖等。具体检测结果见表4。

表4　不同样品中6种糖醇的检测结果 Table 4 determination of the six alditols in different samples

表4　不同样品中6种糖醇的检测结果 Table 4 determination of the six alditols in different samples ND: not detected.