高效液相色谱法同时测定化妆品中的10种合成着色剂


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	朱晓雨

	陈笑梅

	莫卫民

刘海山^1,3 , 钱晓燕², 吕春华^1,3, 朱晓雨^1,3, 陈笑梅¹, 莫卫民²

1. 浙江出入境检验检疫局, 浙江杭州 310016;
2. 浙江工业大学化学工程与材料学院, 浙江杭州 310014;
3. 浙江省检验检疫科学技术研究院, 浙江杭州 310016

收稿日期：2013-05-09

基金项目：浙江出入境检验检疫局课题项目(2012B119).

通讯作者：刘海山,Tel:(0571)28023189,E-mail:liuhs@ziq.gov.cn;

摘要：建立了高效液相色谱同时测定化妆品中颜料橙5、酸性黄36、颜料红53、酸性紫49、罗丹明B、溶剂蓝35、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ、分散黄3和颜料红57等10种合成着色剂的方法。用四氢呋喃(THF)、二甲基亚砜(DMSO)和甲醇对样品进行分步超声辅助萃取、离心净化后,在Eclipse XDB-C₁₈(150 mm×4.6 mm, 5 μm)色谱柱上分离。用乙腈-0.02 mol/L乙酸铵溶液(用乙酸调pH至4.60)作为流动相进行梯度洗脱,二极管阵列检测器(DAD)检测。在0.5~20.0 mg/L范围内,10种着色剂的峰面积与质量浓度呈线性关系,相关系数(r)大于0.999;定量限(LOQ)为10~20 mg/kg。在3个添加水平的回收率均在92.9%~108.8%之间,相对标准偏差(RSD)为0.5%~6.1%(n=6)。该方法简便、快速、灵敏,适合油状、粉状和膏状化妆品中禁限用着色剂的定量检测。

关键词：高效液相色谱着色剂化妆品

Simultaneous determination of 10 synthetic colorants in cosmetics by high performance liquid chromatography

LIU Haishan^1,3 , QIAN Xiaoyan², LÜ Chunhua^1,3, ZHU Xiaoyu^1,3, CHEN Xiaomei¹, MO Weimin²

1. Zhejiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Hangzhou 310016, China;
2. College of Chemical Engineering and Material Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China;
3. Zhejiang Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine, Hangzhou 310016, China

Received: 2013-05-09

Abstract: A high performance liquid chromatographic method was developed for the simultaneous determination of 10 synthetic colorants in cosmetics. The cosmetics were extracted by the ultrasonic technique with tetrahydrofuran (THF), dimethyl sulfoxide (DMSO) and methanol sequentially. Then the extracts were centrifuged for purification and separated on an Eclipse XDB-C18 column (150 mm×4.6 mm, 5 μm) with gradient elution by acetonitrile and 0.02 mol/L ammonium acetate (pH 4.60, adjusted with acetic acid). A diode array detector was used to determine the colorants with the wavelengths ranging from 417 nm to 640 nm. The linear relationships of the 10 colorants between the peak areas and the mass concentrations were obtained in the range of 0.5-20.0 mg/L (r >0.999). The limits of quantitation ranged from 10 to 20 mg/kg. The average recoveries at three concentration levels ranged from 92.9% to 108.8% with the relative standard deviations in the range of 0.5% to 6.1% (n=6). The method is simple, rapid and sensitive. It is suitable for the simultaneous determination of the 10 colorants in the oil cosmetics, cream cosmetics and powder cosmetics.

Key words: high performance liquid chromatography (HPLC) colorants cosmetics

化妆品是与人体直接接触的日用产品,其质量好坏直接关系到消费者的健康。化妆品中含有多种化学物质。因遮盖力、着色力强,有机合成色素被广泛用于指甲油、眼影、唇膏等美容化妆品中。但是很多合成着色剂对人体有害,有些会引起皮肤过敏,甚至致癌、致畸、致突变等^{[ 1, 2 ]}。

我国《化妆品卫生规范》(2007 版)、欧盟化妆品指令76/768/EEC和美国食品药品监督管理局(FDA)对化妆品用着色剂的品种、使用范围和限制条件都作了明确的规定^{[ 3, 4, 5 ]}。我国、欧盟和美国禁止使用的着色剂有颜料橙5 (C.I.12075)、酸性黄36 (C.I.13065)、颜料红53 (C.I.15585)、酸性紫49 (C.I.42640)、罗丹明B (C.I.45170)、溶剂蓝35 (C.I.61554)、苏丹红Ⅱ (C.I.12140)、苏丹红Ⅳ (C.I.26105)和分散黄3 (C.I.11855)等;美国FDA规定禁止颜料红57(C.I.15850, D&C Red No.7)用于眼部化妆品。近几年,我国出口到美国和欧盟的化妆品因违规添加不安全色素而频频遭到通报。因此,建立和发展更可靠、更有效的快速测定化妆品中着色剂的分析方法,对于加强化妆品品质的监督和管理,保护人们身体健康具有十分重要的意义。

目前,对化妆品中有机着色剂的测定主要采用高效液相色谱法(HPLC)^{[ 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ]}、高效液相色谱-串联质谱法^{[ 13 ]}、分光光度法^{[ 14 ]}和胶束荧光法^{[ 15 ]}等。分光光度法灵敏度较低,且容易受到干扰;胶束荧光法灵敏度较高,但只适用于能产生荧光的着色剂,如罗丹明B等;高效液相色谱-串联质谱法灵敏度高、可适用于大部分着色剂检测,但价格昂贵;高效液相色谱法因其高灵敏度以及分析速度快等特点而被广泛应用于化妆品中有害物质的分析测定^{[ 16, 17, 18 ]}。目前已有的研究主要针对一些水溶性色素^{[ 9, 10 ]}、苏丹红^{[ 6, 12 ]}等,针对罗丹明B的报道多为在食品中的检测方法的研究^{[ 19, 20 ]},而能同时检测化妆品中酸性黄36等10种禁用和限用合成着色剂的方法尚未见报道。本文利用高效液相色谱技术建立了同时测定化妆品中酸性黄36等10种合成着色剂的分析方法,操作简便,分析快速、准确,可以很好的用于化妆品实际样品的分析检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪,配G1315B二极管阵列检测器(Agilent公司);冷冻离心机(Thermo公司);漩涡混匀器(太仓市科教器材厂);超声波发生器(美国Branson公司);超纯水净化系统(法国ELGA公司)。

四氢呋喃(THF)和二甲基亚砜(DMSO)(Scharlau公司)为色谱纯;乙酸铵(Amresco公司)、甲醇和乙腈(美国Tedia公司)为HPLC级;冰醋酸(上海凌峰化学试剂有限公司)为分析纯;实验用水为超纯水。

标准品:颜料红57(Pigment Red 57,纯度99.0% ,美国International Laboratory公司);颜料红53 ∶ 1(Pigment Red 53 ∶ 1,纯度90.0% ,日本东京化成工业株式会社);颜料橙5(Pigment Orange 5,纯度91.5% ),苏丹红Ⅱ(Sudan Ⅱ,纯度88.0% ),苏丹红Ⅳ(Sudan Ⅳ,纯度94.4% ),罗丹明B(Rhodamine B chloride,纯度95.0% ),酸性黄36(Acid Yellow 36,纯度99.0% ),分散黄3(Disperse Yellow 3,纯度30.0% ),酸性紫49(Acid Violet 49,纯度90.5% ),溶剂蓝35(Solvent Blue 35,纯度99.0% )均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。颜料红53 ∶ 1(C.I.15585 ∶ 1)与颜料红53 (C.I.15585)的阴离子一致，前者为钡盐，后者为钠盐，因未能获得颜料红53标准品，本方法使用颜料红53 ∶ 1作为标准品。

指甲油、眼影、唇彩和唇膏等化妆品样品均为市售。

1.2 标准溶液的配制

准确称取适量的着色剂标准物质。颜料红57和颜料红53 ∶ 1用DMSO溶解并配制成500 mg/L 的标准储备溶液;颜料橙5用THF溶解并配制成100 mg/L 的标准储备溶液;苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ用THF溶解并配制成500 mg/L 的标准储备溶液;罗丹明B、酸性黄36、酸性紫49用甲醇溶解并配制成1 g/L 的标准储备溶液;分散黄3和溶剂蓝35用甲醇溶解并配制成500 mg/L 的标准储备溶液,密封避光于4 ℃下保存。

移取适量的标准储备液,用甲醇稀释成所需浓度的系列混合标准工作溶液。

1.3 样品处理

准确称取0.50 g样品于10 mL比色管中,加入2.0 mL THF,涡旋2 min,加入1.0 mL DMSO,涡旋混匀后超声提取15 min。再加入7.0 mL甲醇,混匀后超声提取15 min。冷却至室温后,用甲醇定容至10.0 mL,并将全部溶液转移至50 mL离心管中,以 8500 r/min 离心5 min后,取上清液供高效液相色谱分析。

1.4 液相色谱条件

色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈(150 mm×4.6 mm, 5 μ m);流动相A为乙腈,B为0.02 mol/L 乙酸铵溶液(pH 4.60)。梯度洗脱条件:0.0～8.0 min, 35%A～55%A; 8.0～12.0 min, 55%A～98%A; 12.0 min～20.0 min, 98%A; 20.0～22.0 min, 98%A～35%A; 22.0 min～27.0 min, 35%A。流速:1.0 mL/min;进样量:20 μ L;柱温:室温;检测波长:酸性黄36和分散黄3为417 nm;颜料红53、颜料红57、颜料橙5、苏丹红Ⅱ和苏丹红Ⅳ为485 nm;罗丹明B为550 nm;酸性紫49为590 nm;溶剂蓝35为640 nm。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择和优化

2.1.1 检测波长的选择

利用DAD检测器在190～900 nm波长范围内对标准溶液进行扫描,得到各着色剂的紫外-可见光谱图(见图1)。为排除有紫外吸收的杂质在低波长处的干扰,最终选择1.4节所述的检测波长。

图 1 10种着色剂的紫外-可见光谱图 Fig. 1 UV-Vis spectra of the 10 colorants

2.1.2 流动相的选择

这10种着色剂的化学结构和酸碱性有很大差异,其中酸性紫49属于三苯甲烷类染料,溶剂蓝35属于蒽醌染料,罗丹明B属于呫吨染料,其余7种着色剂均属于偶氮染料。要得到良好的峰形和理想的分离效果,流动相pH值的选择非常重要。当选择乙腈与pH 2.00的磷酸二氢钾-磷酸缓冲溶液作为流动相时,颜料红57和酸性黄36无法分离,酸性紫49、颜料红53等出峰较早的化合物峰形不好且灵敏度降低,并且当有机相比例提高时,基线漂移较大;当选择乙腈-0.02 mol/L 乙酸铵溶液(氨水调至pH 8.00)作流动相时,颜料红57的峰消失,并且酸性紫49、酸性黄36、颜料红53等3个待测物的保留时间提前,灵敏度降低;当选择乙腈-0.02 mol/L 乙酸铵溶液(乙酸调至pH 4.60)作流动相时,不仅能将10种着色剂很好的分离,而且得到的峰形较好,灵敏度也优于其他流动相,并且实际样品分析时杂质干扰少,所以最终选择该溶液作为流动相。在优化的色谱条件下,10种着色剂混合标准溶液的色谱图见图2。

图 2 10种着色剂混合标准溶液的色谱图 Fig. 2 HPLC chromatograms of a mixed standard solution of the 10 colorants Peaks: 1. Acid yellow 36; 2. Disperse yellow 3; 3. Pigment red 57; 4. Pigment red 53; 5. Pigment orange 5; 6. Sudan Ⅱ; 7. Sudan Ⅳ; 8. Rhodamine B; 9. Acid violet 49; 10. Solvent blue 35.

2.2 样品前处理条件的选择和优化

2.2.1 提取溶剂的选择

分别考察了甲醇、乙醇、乙腈、甲苯、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和四氢呋喃等溶剂或以上几种溶剂的混合溶剂对油状、粉状和膏状化妆品中目标物的提取效果。结果除THF外其他溶剂都无法溶解膏状样品。分别用THF-DMSO-甲醇和THF-DMF对阳性样品进行提取,THF-DMSO-甲醇的提取效果明显好于THF-DMF。目标物在其中的溶解度也较高,因此实验中选用THF-DMSO-甲醇为提取溶剂。但THF的极性较弱,其在反相色谱中的洗脱能力较强,样品溶液中THF的含量太高会产生一定的溶剂效应,导致色谱峰展宽、拖尾。当THF的用量为2.0 mL时,待测物的提取效率最高,峰形也较好;当THF大于3.0 mL时,部分目标峰开始变形。添加回收试验证明,THF-DMSO-甲醇对指甲油、眼影和唇膏中10种着色剂的提取效果较好。

2.2.2 超声萃取时间的选择

考察两次超声时间分别为0、10、15、20、25、30 min时,对含有罗丹明B的阳性样品的提取效率。结果表明,提取时间较短时目标物未完全溶解,提取不充分;而时间过长时提取效率也会下降,可能发生着色剂的分解变质和共萃取现象^{[ 10 ]}; 15 min时提取效率最佳。添加回收试验也证明,在上述条件下,指甲油、眼影和唇膏中10种着色剂的回收率和精密度较好。

2.3 定量限和线性范围

将着色剂的混合标准溶液逐级稀释成系列标准工作溶液,按浓度从低到高依次进行测定。以待测物的峰面积y对其质量浓度x (mg/L)绘制标准工作曲线,得到的线性回归方程和相关系数见表1。颜料橙5与罗丹明B的定量限为10 mg/kg,其余8种着色剂的定量限均为20 mg/kg(S/N＞10)。

表 1 10种着色剂的线性回归方程、线性范围和相关系数 Table 1 Regression equations, correlation coefficients (r) and linear ranges of the 10 colorants

2.4 回收率和精密度

指甲油、眼影和唇膏空白样品中分别添加LOQ、2倍LOQ和4倍LOQ等3个水平的10种着色剂,每个水平平行测定6次,回收率为92.9% ～108.8% , RSD为0.5% ～6.1% (见表2)。

表 2 指甲油、眼影和唇膏样品中10种着色剂的回收率与相对标准偏差(n=6) Table 2 Recoveries and RSDs of the 10 colorants spiked in nail polish, eye shadow and lipstick samples (n=6)

2.5 实际样品的测定及阳性样品的确认

按本文建立的实验方法分别对市售的81种指甲油、指甲油色浆、眼影、唇彩和唇膏等化妆品中的10种着色剂进行测定。罗丹明B和颜料橙5各有2个样品检出;颜料红53有6个样品检出;颜料红57的检出率最高,共有42个样品检出,其中4个为眼影,含量最高的达3.88% 。对于上述阳性样品，采用如下方法予以确认：将样品由DAD得到的紫外-可见光谱图与浓度相近的标准溶液光谱图比较，若光谱图无明显差别，则可以确认该样品中含有待测物。

3 结论

建立了高效液相色谱法同时测定油状、粉状和膏状化妆品中颜料红57、颜料红53、颜料橙5、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ、酸性紫49、酸性黄36、分散黄3、罗丹明B和溶剂蓝35等10种禁用和限用着色剂的检测方法。该方法快速、简便、灵敏度高、重现性好,能较好地应用于实际化妆品样品的检测,为我国化妆品中禁限用色素的监管和产品质量控制提供了技术支持。

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本文献在全文中的定位：

... 甚至致癌、致畸、致突变等^{[ 1, 2 ]} ...

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... 我国《化妆品卫生规范》(2007 版)、欧盟化妆品指令76/768/EEC和美国食品药品监督管理局(FDA)对化妆品用着色剂的品种、使用范围和限制条件都作了明确的规定^{[ 3, 4, 5 ]} ...

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... 对化妆品中有机着色剂的测定主要采用高效液相色谱法(HPLC)^{[ 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ]}、高效液相色谱-串联质谱法^{[ 13 ]}、分光光度法^{[ 14 ]}和胶束荧光法^{[ 15 ]}等 ...

... 10 ]、苏丹红^{[ 6, 12 ]}等 ...

本文献在全文中的定位：

... 目前已有的研究主要针对一些水溶性色素^{[ 9, 10 ]}、苏丹红^{[ 6 ]}...

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... 可能发生着色剂的分解变质和共萃取现象^{[ 10 ]}; 15 min时提取效率最佳 ...

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... 12 ]、高效液相色谱-串联质谱法^{[ 13 ]}、分光光度法^{[ 14 ]}和胶束荧光法^{[ 15 ]}等 ...

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... 12 ]、高效液相色谱-串联质谱法^{[ 13 ]}、分光光度法^{[ 14 ]}和胶束荧光法^{[ 15 ]}等 ...

本文献在全文中的定位：

... 但价格昂贵;高效液相色谱法因其高灵敏度以及分析速度快等特点而被广泛应用于化妆品中有害物质的分析测定^{[ 16, 17, 18 ]} ...

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本文献在全文中的定位：

... 针对罗丹明B的报道多为在食品中的检测方法的研究^{[ 19, 20 ]} ...

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