色谱  2013, Vol. 31 Issue (11): 1040-1045   PDF (804KB)    
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石莹
张晶
卢丽彬
邵兵
固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定人指甲中的三氯生和三氯卡班
石莹1,2, 张晶1,2, 卢丽彬1,2, 邵兵1,2,3     
1. 首都医科大学公共卫生学院, 北京 100069;
2. 北京市疾病预防控制中心, 食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室, 北京 100013;
3. 北京市预防医学研究中心, 北京 100013
收稿日期：2013-05-20
基金项目：国家自然科学基金项目(21177014);北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划项目.
通讯作者：邵兵,Tel:(010)64407191,E-mail:shaobingch@sina.com;
摘要：建立了人指甲中三氯生和三氯卡班的固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测方法。指甲样品经氢氧化钠消化,C18柱富集净化后,通过Waters ACQUITYTM UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) 分离,以甲醇和水为流动相进行梯度洗脱,采用三重四极杆串联质谱仪负离子模式进行检测,同位素内标法定量。三氯生和三氯卡班分别在0.5~500.0 μg/kg和0.1~100.0 μg/kg范围内线性关系良好,相关系数(r2)均为0.999,方法定量限分别为2.0 μg/kg和0.2 μg/kg。3个水平的平均加标回收率为95.9%~110.2%,相对标准偏差为0.6%~9.7%(n=6)。本方法具有良好的灵敏度、回收率和重复性,适合指甲中痕量目标污染物的测定。利用该方法分析了60份实际样品,目标物的检出率为100%,三氯生和三氯卡班的含量范围分别为<LOQ~760.7 μg/kg和4.1~1926.5 μg/kg。
关键词： 固相萃取     超高效液相色谱-串联质谱     三氯生     三氯卡班     指甲    
Determination of triclosan and triclocarban in human nails by solid-phase extraction and ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
SHI Ying1,2, ZHANG Jing1,2, LU Libin1,2, SHAO Bing1,2,3     
1. School of Public Health, Capital Medical University, Beijing 100069, China;
2. Beijing Key Laboratory of Diagnostic and Traceability Technologies for Food Poisoning, Beijing Centers for Disease Prevention and Control, Beijing 100013, China;
3. Beijing Centers for Preventive Medical Research, Beijing 100013, China
Received: 2013-05-20
Abstract: An analytical method was developed to simultaneously detect triclosan (TCS) and triclocarban (TCC) in human nails using solid phase extraction (SPE) with ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Nail clippings were digested by sodium hydroxide, and then concentrated and purified with C18 cartridges. Chromatographic separation was performed on a Waters ACQUITYTM UPLC HSS T3 column (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) with gradient elution using methanol and water at a flow rate of 0.3 mL/min. The target compounds were determined by triple quadrupole mass spectrometer operated in the negative ion mode and quantified by isotopic-dilution technique. The satisfactory linearities (r2=0.999) was obtained over the ranges of 0.5-500.0 μg/kg for TCS and 0.1-100.0 μg/kg for TCC, with the limits of quantification (LOQs) of 2.0 μg/kg for TCS and 0.2 μg/kg for TCC. The average recoveries of the two target compounds (spiked at three concentration levels) ranged from 95.9% to 110.2%, with the relative standard deviations (RSDs) between 0.6% and 9.7% (n=6). This method can be applied in rapid detection of target contaminants in nails due to its high sensitivity, high recovery and good reproducibility. Sixty collected human nail samples were analyzed by means of the developed method. TCS and TCC were detected in all samples with content ranges of <LOQ-760.7 μg/kg and 4.1-1926.5 μg/kg, respectively.
Key words: solid phase extraction (SPE)     ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)     triclosan     triclocarban     nail    
环境污染物的人群暴露是近年环境科学领域的研究热点,生物监测的结果可直接反映机体对污染物的实际负荷(内暴露)水平,有助于污染物的人群健康效应和风险评估研究[ 1, 2 ]。相对于传统的生物监测基质血液和尿液,指甲样本具有易采集、易储存和转运等优势,更适合大规模人群调查。同时指甲的生长周期较长,可用于长时间慢性暴露研究[ 3 ]。尽管如此,目前指甲中污染物暴露水平监测的研究主要集中在无机元素方面[ 4 ],有关有机污染物的报道非常有限[ 3 ]。

三氯生(triclosan, TCS)及其类似物三氯卡班(triclocarban, TCC)为广谱抗菌剂,广泛用于各类个人护理品、厨房用具、玩具、纺织品以及医用器械[ 5, 6 ]中。毒理学研究显示TCS能够影响北美牛蛙蝌蚪时期甲状腺激素相关基因的表达[ 7 ],降低大鼠的精子数量和雄激素水平[ 8 ]; TCC可以协同增强雌二醇和睾酮的生物活性[ 9, 10 ]。这些潜在的内分泌干扰效应引发了学界对三氯生影响人体健康的担忧。目前,美国、瑞典等国家开展了TCS和TCC的人体暴露水平研究,监测基质包括血液、尿液和母乳[ 11, 12, 13 ]。我国相关的研究尚属空白,为了考察指甲能否作为替代的监测基质进行人群调查,有必要建立指甲中目标化合物的检测方法。

复杂样本中TCS和TCC的分析方法涉及的仪器主要有毛细管电泳仪、气相色谱-质谱仪和液相色谱-质谱联用仪等[ 14, 15, 16, 17, 18 ];前处理技术包括液液微萃取、固相萃取(SPE)、在线固相萃取等[ 13, 16, 17, 18, 19]。毛细管电泳法试剂和样品消耗少、成本低,但灵敏度较低[ 15 ];气相色谱-质谱法前处理过程一般需要衍生化,操作复杂[ 16 ]。对于样品处理方法,液液微萃取技术目前主要用于水体等环境基质中,在生物样品中应用较少[ 16, 19 ];在线固相萃取有赖于特定的仪器,不适合推广[ 13, 18 ]。本文采用固相萃取-高效液相色谱-串联质谱技术,实现了指甲样本中三氯生和三氯卡班的同时测定。



1 实验部分
1.1 仪器与试剂

ACQUITYTM超高效液相色谱仪-XevoTMTQ-S三重四极杆质谱仪(美国Waters公司); Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司);高速台式离心机(德国Zentrifugen公司);水浴摇床(英国Stuart公司); Oasis HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL)和Sep-Pak C18固相萃取柱(200 mg/3 mL,美国Waters公司)。

三氯生(纯度为99.5% )和三氯卡班(纯度为99% )分别购自德国Dr. Ehrenstorfer公司和加拿大Toronto Research Chemicals公司;同位素内标三氯生-13C12(TCS-13C12)和三氯卡班-13C6 (TCC-13C6) 均由英国剑桥同位素实验室提供,纯度为99% 。甲醇、乙腈均为色谱纯(美国Dikma公司);氢氧化钠(NaOH)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、盐酸(36% , HCl)和乙醇均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司);实验用水均为超纯水(18.2 M Ω ·cm);磷酸盐缓冲溶液(配制0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液,用氢氧化钠调节pH至5.0±0.1)。

1.2 标准溶液配制

分别准确称取10.0 mg标准品,溶于甲醇并定容至10 mL,配制成 1000 mg/L 标准储备溶液,于-20 ℃保存于棕色小瓶中。临用时用80%(v/v,下同)的甲醇水溶液稀释,配制成不同浓度的混合标准工作液,于4 ℃保存。

1.3 样品采集

收集样品前告知每位受试者研究的目的及意义,并签署知情同意书。分别剪下受试者十指的手指甲和脚趾甲,装入两个塑料密封管中,室温条件下储存直至分析检测。

1.4 样品预处理

将约100 mg指甲水浴超声10 min,再用乙醇浸泡1 h,重复3次。洗净的指甲在50 ℃烘箱中烘干,称重后转移至15 mL离心管中,先加入100 μ L混合内标溶液(TCS-13C12和TCC-13C6 的质量浓度分别为40.0 μ g/L 和4.0 μ g/L),再加入1 mL NaOH溶液(2 mol/L),于50 ℃水浴摇床中消解过夜。冷却到室温后,用盐酸调节pH至5,加入3 mL乙腈和6 mL磷酸盐缓冲溶液,漩涡混匀后以 9000 r/min 离心5 min,转出上清液待固相萃取用。C18小柱依次用3 mL甲醇和3 mL水活化,上样完毕后,先用3 mL 60%甲醇水溶液淋洗,再用3 mL甲醇洗脱。收集洗脱液,在微弱的氮气流下吹干,用80%甲醇水溶液定容至200 μ L,供UPLC-MS/MS测定。

1.5 分析检测条件
1.5.1 色谱条件

色谱柱:Waters ACQUITYTM UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μ m);柱温:40 ℃;进样量:5 μ L。流动相A为甲醇,流动相B为水;流速:0.3 mL/min;梯度洗脱条件:0～4.0 min, 75%A～100%A; 4.0～5.0 min, 100%A; 5.0～5.1 min, 100%A～75%A; 5.1～7.5 min, 75%A。

1.5.2 质谱条件

离子源:电喷雾离子源,负离子模式(ESI-);毛细管电压:1.0 kV;离子源温度:135 ℃;脱溶剂气温度:500 ℃;脱溶剂气(N2)流量:1000 L/h;碰撞室压力:4.95×10-2Pa。采用多反应监测模式(MRM),具体参数见表1。

表 1 各目标化合物的UPLC-MS/MS参数 Table 1 UPLC-MS/MS parameters for the analysis of target compounds
1.6 统计分析

采用SPSS 17.0进行统计分析,分析物浓度低于LOQ的数值取值为LOQ/2[ 20 ]。采用配对符号秩和检验(Wilcoxon matched-pairs signed-ranks test)比较手指甲和脚趾甲中目标物的浓度差异。

2 结果与讨论
2.1 前处理条件的优化
2.1.1 样本预处理

指甲样本中有机物检测的预处理步骤包括清洗和消化。前者的目的是洗净表面泥沙,去除表面松散结合的外源性目标物,本研究采用水浴超声和乙醇浸泡的方式对指甲进行清洗。消化过程中所用的消解液通常为强酸或强碱,无机元素的消解一般使用硝酸、高氯酸等强酸。为避免强酸氧化造成目标化合物损失,选择2 mol/L NaOH用作消解液。

2.1.2 SPE柱的选择

由于均一、足量、空白的人指甲样品很难获得,而猪趾甲(检测未发现目标物)与人甲的构成相似,主要成分均为角质蛋白,因此选择猪甲作为人甲的替代材料进行实验方法的开发和确证[ 21 ]。

本实验采用固相萃取技术完成指甲中分析物的富集和净化,由于TCS和TCC亲脂性较强(辛醇/水分配系数log Kow分别为4.8和4.9),选择两种反相的C18和HLB固相萃取小柱进行比较。考虑到上样液的pH可能会影响SPE的萃取效果,少量的有机溶剂会减小管壁的吸附,提高回收效率,因此,将猪甲消解液加标后,用盐酸调节至不同pH(3、5和7),再加入3 mL乙腈,混匀后分别上样于两种固相萃取小柱,每个条件设3个平行,回收率见图1。就TCS来说,C18柱的平均回收率为101.5% ～102.3% ,优于HLB柱(78.8% ～98.8% ); pH对TCS回收率的影响不明显。TCC在C18和HLB上的效果十分相近,但受pH影响较大,在pH 5时回收率最佳,两小柱的回收率均在95%以上。最终采用pH 5时C18柱富集净化。

图 1 不同pH值的上样液中目标化合物在C18柱和HLB柱上的绝对回收率(n=3) Fig. 1 Recoveries (n=3) of target compounds using C18 and HLB cartridges in loading solution at different pH values
2.1.3 复溶体积的考察

由于指甲的样本量很少,通常在100 mg以下,浓缩倍数对方法的灵敏度影响较大;但另一方面,在液相色谱-质谱分析过程中,由于基质中共流出物的干扰和电离竞争抑制的存在,易导致基质抑制效应,通常浓缩倍数越大,基质抑制越强。本实验采用80%甲醇水溶液为定容液,比较了采用100、200、500和 1000 μ L溶液复溶时的基质抑制率。其计算公式为(1-相同浓度的基质匹配标准溶液和纯标准溶液的峰面积比值)×100% ,结果为正时表示基质抑制,结果为负时表示基质增强[ 22 ]。从图2可知,定容液超过500 μ L,两目标物基本无基质抑制现象,TCC最高抑制仅20% ;定容液为200 μ L时,TCS和TCC的基质抑制分别为20%和36% ;而降低至100 μ L定容时,对两分析物的抑制均超过了40% 。由于100 μ L定容操作不便,且本研究采用同位素内标法进行定量,因此选择了200 μ L。

图 2 不同复溶体积条件下的基质抑制率(n=3) Fig. 2 Matrix suppression (n=3) of target compounds at different reconstituted volumes
2.2 标准曲线、检出限与定量限

为了补偿基质效应和样品前处理过程中目标物的损失以及仪器波动,本实验采用同位素内标稀释法进行定量分析。配制系列混合标准工作液,使TCC的质量浓度分别为0.1、0.2、1.0、2.0、10.0、40.0和100.0 μ g/L, TCS的质量浓度为TCC的5倍,内标TCC-13C6 和TCS-13C12的质量浓度分别为2.0 μ g/L 和20.0 μ g/L。以目标组分峰面积与相应内标峰面积的比值Y对相应质量浓度X( μ g/L)进 行线性回归。以100 mg猪甲加标样品中待测化合物色谱峰的信噪比等于3(S/N=3)对应的含量为方法的检出限(LOD), S/N=10对应的含量为方法的定量限(LOQ)。TCS和TCC的线性方程、相关系数(r2)、线性范围、检出限和定量限见表2。结果表明,目标化合物在上述浓度范围内线性良好。当实际样品中目标物浓度值超出标准曲线范围时,需稀释后再定量检测。

表 2 目标化合物的线性方程、相关系数(r2)、线性范围、检出限(LOD)和定量限(LOQ) Table 2 Regression equations, correlation coefficients (r2), linear ranges, limits of detection (LODs)and limits of quantification (LOQs) for target compounds
2.3 回收率和精密度

在猪甲样品中添加不同浓度的混合标准溶液,使TCS的加标水平分别为2.0、20.0和200.0 μ g/kg, TCC分别为0.2、2.0和20.0 μ g/kg,每个水平设6个平行。按照1.4节步骤进行前处理,1.5节液相色谱-质谱条件进行测定,内标法校正,计算目标物的回收率和相对标准偏差(RSD),结果见表3。TCS和TCC的回收率为95.9% ～110.2% ,相对标准偏差为0.6% ～9.7% 。选取一个浓度水平(TCS: 20.0 μ g/kg; TCC: 2.0 μ g/kg)连续进行5天的加标回收试验,获得方法的日间精密度,两目标化合物均低于10% ,表明该方法具有较好的重复性和稳定性。

表 3 猪甲中2种目标化合物的回收率及相对标准偏差(n=6) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the two target compounds in spiked pig nails (n=6)
2.4 实际样品检测

采集30名志愿者的手指甲和脚趾甲,共获得60份样品。按照上述方法进行检测,具体结果见表4。所有的指甲样品中均检测出两种目标物,TCS和TCC的含量范围分别为＜LOQ～760.7 μ g/kg 和4.1～1926.5 μ g/kg。推测由于TCS和TCC被广泛添加入牙膏、肥皂等日用品中,反复的黏膜和皮肤接触导致人体对其吸收和富集[ 18, 23 ],造成了指甲样本的高检出率。图3为标准溶液和某指甲样品采集所得的色谱图。另一方面,实际样品的分析结果显示出个体间目标物含量差异明显:手、脚指甲中TCS的含量范围分别为＜LOQ～760.7 μ g/kg 和＜LOQ～478.8 μ g/kg,均值和中位数分别为98.3 μ g/kg 和48.4 μ g/kg 及37.1 μ g/kg 和10.4 μ g/kg;手、脚指甲中TCC的含量分别为4.1～1926.5 μ g/kg 和4.4～1391.0 μ g/kg,均值和中位数分别为327.0 μ g/kg 和104.1 μ g/kg 及191.0 μ g/kg 和48.1 μ g/kg。文献[ 24 ]报道,由于脚趾甲更少接触外源性的污染物,可能比手指甲更适合作为生物监测基质,能够更准确地反映机体实际负荷水平。本研究初步探索了手、脚指甲中目标物含量是否存在差异,经统计分析表明手指甲中TCS和TCC的含量均明显高于脚趾甲中的含量,差异有统计学意义(p ＜ 0.05)。但是由于本次试验采集的样本量相对较少,后续研究需要进一步扩大样本量。

表 4 实际样品中TCS和TCC的含量 Table 4 Contents of TCS and TCC in real samples

图 3 (a)5.0 μ g/L TCS和0.5 μ g/L TCC标准溶液和(b)某实际样品的MRM色谱图 Fig. 3 MRM chromatograms of (a) 5.0 μ g/L TCS and 0.5 μ g/L TCC standard solution and (b) a real human nail sample Both standard solution and human nail sample contained 20.0 μ g/L TCS-13C12 and 2.0 μ g/L TCC-13C6, respectively.
3 结论

利用强碱消化,C18固相萃取小柱净化,结合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术建立了指甲中三氯生和三氯卡班两种环境有机污染物的检测方法。该方法线性良好,具有较高的重现性和精密度,各项指标均满足痕量分析的要求。应用该方法对采集的60份指甲样品进行了检测,均可检测到目标物,含量在 μ g/kg～mg/kg水平。后续研究将把指甲、血液和尿液中的目标物含量进行比对,探讨指甲能否作为替代的监测基质;并进一步扩大样本量,按照不同的性别、年龄、地区及生活习惯等抽取样本,监测我国居民TCS和TCC暴露水平,为正确评估其健康风险和采取相应的风险规避对策提供科学依据。

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