色谱  2013, Vol. 31 Issue (11): 1087-1092   PDF (790KB)    
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陈平
陈益民
陈佳
童鸿斌
许志良
液相色谱-质谱法研究附子生物碱的煎煮减毒机理
陈平1, 陈益民1, 陈佳2, 童鸿斌2, 许志良2,3     
1. 浙江省中医院, 浙江 杭州 310006;
2. 浙江中医药大学, 浙江 杭州 310053;
3. 中国科学院大连化学物理研究所, 辽宁 大连 116023
收稿日期：2013-05-27
基金项目：科技部国际科技合作项目(2009DFA41250).
通讯作者：许志良,E-mail:xzl8811@sina.com.
摘要：建立了基于液相色谱-质谱分析的附子中生物碱指纹分析方法,并将其应用于附子煎煮减毒的机理研究。基于质谱特征鉴定了生物碱标准品在加热回流过程中产生的6种降解产物,确定了双酯型生物碱的煎煮条件降解规律。在此基础上研究了附子饮片煎煮不同时间条件下生物碱的指纹变化,结果表明,长时间煎煮可明显降低双酯型生物碱和生物脂碱的浓度,为附子的安全用药提供了科学依据。
关键词： 高效液相色谱-质谱     生物碱     附子     煎煮     减毒机理    
Exploration of toxicity reducing mechanism of aconite alkaloids during decoction process using liquid chromatography-mass spectrometry
CHEN Ping1, CHEN Yimin1, CHEN Jia2, TONG Hongbin2, XU Zhiliang2,3     
1. Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310006, China;
2. Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China;
3. Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China
Received: 2013-05-27
Abstract: A high performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry method was developed for the determination of aconite alkaloids. It was used to investigate the degradation of alkaloids of Radix Aconiti Lateralis Preparata during decoction. Six alkaline degradation products were identified, and the degradation regularity of diester-diterpenoid alkaloids was confirmed during the test using standards. The dynamic changes of the amount of aconite alkaloids in the decoction of Radix Aconiti Lateralis Preparata were supervised. Along with the increase of decoction time, the concentrations of diester-diterpenoid alkaloids and lipo-alkaloid decreased significantly. The results can provide a scientific basis for the safety use of aconite.
Key words: high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS)     alkaloids     Radix Aconiti Lateralis Preparata     decoction     toxicity reducing mechanism    
中药历史源远流长,有数千年的临床实践经验。随着中药的使用越来越广泛,中药的不良反应在国内外引起了越来越多的重视[ 1 ]。最早的中药典籍《神农本草经》中共收录365种药物,并将其分为上、中、下品,其中下品多为有毒中药,在使用上有着较为严格的适应症和用法用量。这表明中医对中药的安全性有清醒的认识,经过长期实践逐渐形成了一个比较系统的中药炮制配伍减毒的方法和理论。应用现代科学技术对有毒中药的化学成分进行深入研究有助于了解其毒性成分以及毒性成分的降解产物,对于有毒中药的安全用药非常重要。

附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.子根的加工品,具有镇痛、消炎、强心和抗癌等广泛的药理作用,但具有很强的毒性。生附子可加工炮制为盐附子、黑附子(黑顺片)、白附片、淡附片、炮附片等不同的饮片,以降低毒性,如炮制不当或剂量过大以及煎煮时间不够,仍可引起较强的中毒反应。

附子的主要化学成分C19二萜乌头碱类生物碱(见图1)按取代基结构不同分为3类:非酯型生物碱(胺醇型生物碱)、单酯型生物碱、双酯型生物碱和生物脂碱[ 2, 3, 4 ]。其中双酯型生物碱毒性最强,是单酯型生物碱的100～200倍,是胺醇型生物碱的 2000～4000 倍。双酯型生物碱在生附子中含量最高,主要的有乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等,小鼠口服半数致死量仅为1.8、1.9、5.8 mg/kg[ 5 ]。双酯型生物碱可水解掉一个酯键,变成单酯型生物碱,两个酯键均水解掉变成胺醇型生物碱,这就是中药炮制减毒的主要机理[ 6, 7, 8, 9 ]。

图 1 附子生物碱的化学结构 Fig. 1 Chemical structures of alkaloids in Radix Aconiti Lateralis Preparata (Fuzi) OAc: CH3COO; OBz: C6H5COO.

附子生物碱指纹分析、质量控制和炮制配伍减毒的研究[ 10, 11, 12 ]成为附子化学研究的重点。本文基于高效液相色谱-质谱联用方法建立了附子中生物碱的快速分析方法,对附子中的生物碱在长时间煎煮条件下的降解规律进行了研究。



1 实验部分
1.1 原料及试剂

生附子(干品)购自华东医药股份有限公司中药饮片部,由浙江省中医药大学曹灵勇副教授鉴定为毛茛科植物乌头的子根加工品。

次乌头碱(hypaconitine)、新乌头碱(mesaconitine)、 乌头碱(aconitine)、苯甲酰新乌头原碱(benzoylmesaconine)、苯甲酰乌头原碱(benzoylaconine)、苯甲酰次乌头原碱(benzoylhypaconine)均购自上海同田生物技术股份有限公司(纯度均＞98% ),分析纯甲酸购自Sigma公司,色谱纯乙腈购自Merck公司,超纯水采用Milli-Q超纯水系统制备。

1.2 样品处理

标准品采用乙腈溶解配制成100 mg/L 混合母液,采用80%乙腈水溶液稀释配制成0.1 mg/L 标准混合溶液。所有中药饮片采用中药粉碎机粉碎,60目过筛备用。取0.1 g中药饮片粉末加入1 mL乙腈室温超声提取60 min,提取液经 12000 g离心10 min。上清液供HPLC-MS分析。

煎煮减毒研究:取9 g中药粉末,加入250 mL超纯水至500 mL圆底烧瓶中,加热至沸腾,回流煎煮。每隔30 min取2 mL溶液,以 5000 g离心5 min,取200 μ L上清液于离心管中加入4倍体积的乙腈振荡混匀后置于4 ℃冰箱中放置过夜,以 12000 g离心10 min,取上清液供HPLC-MS分析。

1.3 液相色谱-质谱分析

液相色谱分析采用Thermo AccelaTM HPLC系统(Thermo Fisher Scientific, 德国),包括四元低压梯度泵、在线脱气机、柱温箱和温控自动进样器。使用的色谱柱为Shim-pack XR ODS柱(50 mm×2.0 mm, 2.2 μ m) (Shimadzu,日本)。样品架控制温度为4 ℃,柱温箱设定为40 ℃,流速0.3 mL/min,进样量为1 μ L。流动相A: 0.1%甲酸水溶液;流动相B: 0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脱条件如下:起始流动相为10%B, 10 min时变化到50%B, 15 min时变化到95%B,保持2 min,恢复到初始流动相,平衡3 min。

质谱检测采用LTQ质谱仪(Thermo Fisher Scientific, 德国),采用ESI+进行检测。扫描范围为m/z 400～900,毛细管温度315 ℃,鞘气流速设定40 arb,辅助气流速为5 arb,喷雾电压4.5 kV,毛细管电压40 kV,透镜电压100 V。数据依赖的动态二级质谱,动态阈值为 1000,碰撞能为35 eV,窗口为1.5。

1.4 数据处理

采用Xcalibur 2.0.1(Thermo Fisher Scientific, 德国)进行定性和定量分析。

2 结果与讨论
2.1 分析方法的建立

建立HPLC-MS分析方法用于附子中生物碱的指纹分析,优化后的分析时间为20 min(包括柱平衡), 0.1 mg/L 混合标准溶液的HPLC-MS基峰图如图2a所示,次乌头碱和乌头碱在色谱图中没有分离,但根据质谱信息可以获得良好的区分。

图 2 (a)标准混合溶液和(b)生附子提取液的HPLC-MS基峰色谱图 Fig. 2 HPLC-MS base peak chromatograms of (a) a standard mixture and (b)a Fuzi extract 1. benzoylmesaconine; 2. benzoylaconine; 3. benzoylhypaconine; 4. mesaconitine; 5. hypaconitine; 6. aconitine.

HPLC-MS分析附子提取物(乙腈超声萃取60 min)的典型基峰谱图如图2b所示,色谱峰分3个区间,时间分别为0～4、4～10和10～14 min,流出物的质荷比分别为400～500、500～800和大于800,根据质谱的N规则判断,大部分为含氮化合物,结合质荷比和疏水性差异,可初步判断区间I流出的主要为非酯型生物碱(胺醇型生物碱),区间II为单酯和双酯型生物碱(其中单酯型流出较早),区间III为生物脂碱。采用质谱、二级质谱断裂规律对流出的生物碱进行了定性研究,结合文献[ 12 ]数据比对,在生附子提取液中共鉴定出33种生物碱。

2.2 附子中生物碱在煎煮条件下的降解减毒研究

取标准混合溶液,加超纯水稀释至50 mL置于250 mL圆底烧瓶中,加热回流4 h,每隔30 min取0.2 mL样品进行质谱分析,0、30和240 min的谱图见图3。由于采用加热回流,可认为在煎煮过程中萃取液的体积没有明显变化,检出峰面积(峰高)可直接体现萃取液中生物碱的含量变化。

图 3 不同加热回流时间下标准混合溶液的HPLC-MS总离子流图 Fig. 3 HPLC-MS TIC chromatograms of standard solution at different times of heating reflux Peak numbers are the same as in Fig. 4.

从图3可看出煎煮30 min时出现了6个新的化合物,其二级质谱图如图4所示。在单酯型生物碱流出区域出现3个新的化合物(4,5,6),质荷比(m/z)分别为572.4、586.4和556.4,与二酯型生物碱的二级质谱基峰质荷比一致。保留时间为5.39 min、m/z为586.4的化合物,二级质谱碎片离子归属为: m/z 568.39 [M+H-H2O]+,m/z 554.40 [M+H-CH3OH]+, m/z 536.43[M+H-CH3OH-H2O]+,m/z 522.41[M+H-2CH3OH]+, 该化合物鉴定为去乙酸苯甲酰乌头原碱(dehydrated benzoylaconitine),为乌头碱的水解产物。其他两个定性为去乙酸苯甲酰次乌头原碱和去乙酸苯甲酰新乌头原碱,分别为次乌头碱和新乌头碱的水解产物。结合水解规律和质谱信息,证明该水解过 程为:双酯型生物碱C8位发生脱羧反应,在C8和C9 位形成双键,形成水解型单酯型生物碱。

图 4 水解产物的二级质谱图 Fig. 4 MS/MS spectra of hydrolyzed products PI: parent ion (m/z).

保留时间接近死时间的3个水解产物为单酯型生物碱进一步脱酯生成的胺醇型生物碱,根据质谱信息分别确定为乌头原碱(乌头胺)、新乌头原碱(新乌头胺)及次乌头原碱(次乌头胺)。6个水解产物的定性结果如表1所示。

表 1 生物碱的水解产物 Table 1 Hydrolyzed products of aconitum alkaloids

以新乌头碱相应标准品及其水解物的峰面积变化考察生物碱随煎煮时间的水解变化规律(见图5)。从图5中可以看出在30 min内中乌头碱几乎全部降解;与此同时苯甲酰新乌头原碱和去乙酸苯甲酰新乌头原碱含量在30 min时有所增加,随着加热回流时间的增加含量逐渐降低;新乌头胺含量随煎煮时间持续增加。表明在水解过程中二酯型生物碱先水解转化为单酯型生物碱和水解型单酯型生物碱,然后进一步水解成生物原碱(胺醇型生物碱)。

图 5 加热回流过程中新乌头碱及其水解物的含量变化 Fig. 5 Content changes of mesaconine and its hydrolysates during heating reflux

取生附子粉末3份平行加水加热回流,同样每隔30 min取样分析,考察不同水解时间下生物碱含量的变化,其HPLC-MS总离子流图如图6所示。对比煎煮30 min和240 min谱图可发现双酯型生物碱(图中区间III)含量下降非常明显;单酯型生物碱(图中区间II)中的水解型单酯生物碱在煎煮30 min谱图中有明显检出,而到240 min时,含量同样明显降低;非酯型生物碱(图中区间I)在煎煮过程中含量有少量的下降(约降低20% );与之相反,单酯型生物碱(图中区间II)中的苯甲酰生物碱含量有较为明显的上升,同时生物原碱含量也有所上升。以乌头原碱类型生物碱含量变化考察不同类型生物碱在煎煮过程中的变化规律,3次煎煮测定的均值及标准偏差见图6。

图 6 不同加热回流时间下生附子提取液的HPLC-MS 总离子流图 Fig. 6 HPLC-MS TIC chromatograms of Fuzi extract at different times of heating reflux I. nonester-type alkaloids; II. monoester-type alkaloids; III. diester-type alkaloids.

从图7可以看出,乌头碱的含量在前120 min显著降低(含量仅为30 min时的3.8% ),然后呈现缓慢降低趋势。去乙酸苯甲酰乌头原碱(dehydrated benzoylhypaconine)含量一直保持平稳下降态势;苯甲酰乌头原碱的含量在前150 min显著增加,超过150 min后含量达到稳定;乌头原碱含量一直保持缓慢上升态势。对比谱图积分数据,新乌头碱和次乌头碱的变化规律与之类似。生附子饮片粉末煎煮过程中生物碱的变化规律与标准溶液煎煮结果略有差异,在标准溶液煎煮过程中双酯型生物碱30 min已完全水解,同时苯甲酰生物碱随时间呈明显下降态势;这一差异可能与生物碱在煎煮提取过程中的提取效率以及溶液的基质效应密切相关。从煎煮实验可以看出附子的煎煮时间需要超过2 h才能明显降低其中双酯型生物碱的含量,达到减毒的目的,这与中医药对附子煎煮时间要求一致。

图 7 加热回流过程中萃取液中生物碱的含量变化 Fig. 7 Content changes of alkaloids in Fuzi extract with heating reflux time
3 结论

本工作建立了基于高效液相色谱-质谱联用的生物碱指纹分析方法,采用标准品加热回流,考察了生物碱在煎煮过程中的水解规律,发现双酯型生物碱先水解转化为单酯型生物碱和水解型单酯型生物碱,然后进一步水解成生物原碱;鉴定了6种生物碱水解产物。在此基础上考察了生附子饮片在长时间煎煮条件下的生物碱降解规律,表明需要煎煮120 min双酯型生物碱含量才发生显著降低,验证了中医药对附子煎煮时间要求的科学性。本研究结果对附子的安全用药提供了科学依据。

参考文献
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