目前,在血液中规模化鉴定N-糖基化蛋白的手段还不是很成熟。首要的原因是血液中蛋白质含量的动态范围非常高(大约12个数量级)。血清白蛋白、免疫球蛋白等22种高丰度蛋白质占总蛋白质含量的99%[ 5, 6 ]。而绝大多数可作为生物标志物的糖蛋白在血浆中表达量较低,所以给检测带来了较大的挑战。因此,糖蛋白富集有利于鉴定到更多的糖蛋白。其次,糖蛋白上的糖链具有高度的宏观及微观不均一性,质谱很难测定糖蛋白精确的化学结构,糖型不均一性导致单一蛋白质异构体丰度的降低,也导致检测灵敏度的降低。此外,由于糖基化肽段往往只占蛋白质酶解肽段的5%或更少[ 7 ],在质谱分析的过程中,其质谱信号很容易受到非糖肽的抑制,因此糖蛋白质组学研究所面临的首要问题是糖蛋白/糖肽的有效富集与分离,即去除非糖蛋白/非糖肽。
目前,糖肽与糖的富集方法大体上可分为以下几种:凝集素亲和富集(lectin affinity)、亲水色谱法富集(HILIC)、酰肼富集(hydrazine chemical)、二氧化钛富集、硼酸富集以及体积排阻(ultrafiltration)等[ 8, 9, 10, 11 ]。在这些富集方法中,凝集素富集糖基化蛋白/肽段应用最为广泛,但是凝集素的价格较贵,每种凝集素只能特异性地富集一种糖型,如果规模化分析样品中的所有N-糖蛋白只能多种凝集素联合使用,但是这样会使凝集素的富集效率降低[ 12 ],而且结合后的糖蛋白/肽段需要用高浓度的糖才能够洗脱下来,操作麻烦,还容易造成样品损失;虽然可以在凝集素上直接切糖从而释放去糖基化后的肽段,但是糖链的结构信息就会丢失。酰肼富集虽然有较好的特异性,但操作步骤多,且糖型因氧化而被破坏。最近,随着亲水相互作用色谱技术的不断发展,其在多肽分离、药物分析等方面都有较好的应用[ 13 ]。亲水色谱富集作为通用的糖蛋白/肽段富集手段,操作简单,不破坏糖型,可以一次鉴定到糖和糖肽,具备广阔的应用前景。
尽管亲水色谱法富集糖蛋白/糖肽具有操作上的优点,但是该方法在糖蛋白/糖肽富集上的应用相对较少,与凝集素亲和富集和酰肼富集相比较,其规模化鉴定的数量还不令人满意[ 14 ]。在本研究中,首先将两性离子亲水(ZIC-HILIC)材料填加到以移液枪头为载体、C8膜为筛板的小柱中,制成亲水富集柱。利用标准糖蛋白对富集效率进行考察,并将优化的方法应用于实际样本中,最终在健康人血浆中共鉴定到了来源于299个N-糖基化蛋白的637个糖基化位点,同时鉴定到31种不同的N-糖糖型。该研究结果表明,采用自制亲水相互作用色谱小柱,可以有效富集糖链和糖肽,且操作简单,为寻找糖蛋白生物标志物提供了可靠的方法。
Q-Exactive质谱仪(美国Thermo Fisher公司); 4800 Plus MALDI-TOF-TOF MS(美国ABI公司); Easy-nano LC 1000液相色谱系统(美国Thermo Fisher公司);
健康人血浆样品来源为中国人民解放军307医院。血浆样本获得知情同意并经过伦理委员会通过,采用封闭式的真空采血方法。蛋白质标准品牛血清白蛋白(bovine albumin, BSA)以及牛胎球蛋白(fetuin)购自美国Sigma-Aldrich公司。PNGase F酶来源于美国New England Biolabs公司。测序级的胰蛋白酶购自美国Promega公司;十二烷基磺酸钠(SDS)、甲酸(FA)、三氟乙酸(TFA)、HPLC级的乙腈(ACN)、碳酸氢铵(NH4HCO3)、尿素(urea)、Tris-HCl和NaCl等试剂均来源于Sigma-Aldrich公司;去离子水来源于Milli-Q A10系统(Millipore公司)。二硫苏糖醇(DTT)和碘乙酰胺(IAA)购于Acros公司。ZIC-HILIC亲水材料购自Merck公司;C8筛板购自3M Bioanalytical Technologies公司；3 kDa超滤管购自Millipore公司。
蛋白质的酶切参考FASP(filter aided sample preparation)方法[ 15 ],详细过程如下:将0.6 mg血浆样品加入到20 μ L裂解液中(40 g/L SDS, 100 mmol/L DTT, 20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.6), 95 ℃变性10 min。待样品降至室温后加入到200 μ L蛋白质水化液中(8 mol/L 尿素,20 mmol/L Tris-HCl, pH 8.5,简称UA)，然后将其加入到30 kD的超滤离心管中,20 ℃ 15000 g离心15 min,在超滤管中加入200 μ L UA,采用与上面相同的条件离心15 min,加入含有50 mmol/L IAA的UA 100 μ L,黑暗处放置30 min, 15000 g离心10 min。在超滤管中加入100 μ L UA,采用与上面相同的条件离心10 min,最后用100 μ L 50 mmol/L 碳酸氢铵洗两次。换一个新的套管,再加入含有12 μ g胰蛋白酶的50 mmol/L 碳酸氢铵溶液(pH 7.8)反应过夜12 h。酶切完成后,将100 μ L 0.5 mol/L NaCl溶液加入到超滤管中以 14000 g离心15 min,重复离心一次后收集超滤下来的肽段。用NanoDrop测量肽段含量。
糖肽富集:取5 mg ZIC-HILIC粉末加入到100 μ L活化液(体积分数为0.5%的FA水溶液)中活化30 min, 1000 g离心1 min,小心移去上清液,然后再加入到1×Binding Buffer(结合缓冲液：80%(体积分数) ACN, 5%(体积分数) FA, 15%(体积分数) H2O,简称BB)中,充分混匀30 s后,1000 g离心1 min,弃去上清液,再重复一次。将冻干的肽段样品加入到100 μ L 1×BB中,充分溶解后加入到平衡好的ZIC-HILIC填料中,放置在摇头机上室温下混匀1 h。将C8筛板填入到200 μ L枪头的尖端,再将混合ZIC-HILIC填料后的样品加入到装好C8筛板的200 μ L枪头中,用注射器加压方式将溶液从枪头中排出,再用100 μ L 1×BB重复洗5次,然后换成100 μ L 0.5%FA溶液将糖肽从ZIC-HILIC上洗脱下来。将洗脱得到的样品旋转蒸干(使FA充分挥发掉),再加入50 μ L含有100 U PNGase F的50 mmol/L NH4HCO3溶液,于37 ℃下放置4 h,待充分酶切后冷冻干燥,C18脱盐。
糖富集:首先将100 μ g酶切血浆肽段的冻干样品复溶在50 μ L的NH4HCO3溶液中,加入100 U的PNGase F酶,在37 ℃下放置4 h。后续糖富集过程与糖肽富集方法一致,洗脱下的糖冻干后待MALDI-TOF-TOF-MS分析。
预分离使用Beckman的PF-2D液相色谱系统,Durashell RP色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m,天津博纳艾杰尔科技有限公司),流动相:A相为2%ACN-98%H2O, B相为98%ACN-2%H2O (用氨水调pH至10),液相色谱分离总时间为40 min,采用线性梯度,流动相B液从流动相总体积的5%上升到50%的洗脱时间设为27 min,其中每隔40 s进行一次收集,共收集36管,并合并成12管:A (1, 13, 25)， B(2, 14, 26)， C(3, 15, 27)，…， L(12, 24, 36);合并后的样品旋转蒸干,准备进行LC-MS/MS分析。
采用Q-Exactive质谱仪进行检测,装配纳升级电喷雾源,液相色谱系统采用Easy nano LC 1000。流动相组成:A相,2%ACN-98%H2O-0.1%FA; B相,80%ACN-20%H2O-0.1%FA。整个液相色谱分离时间为78 min,采用线性梯度,B相从流动相总体积的5%上升到50%的洗脱时间设为35 min,流速为300 nL/min。质谱采集采用数据依赖型扫描模式(Data Dependent MS/MS Scan)。扫描范围为m/z 300～1400,一级质谱的离子注入时间(injection time)为80 ms,自动增益控制值为5×106,一级质谱最强的50个离子进入高能诱导碎裂(HCD)中碎裂,在Orbitrap中进行二级串联质谱分析。MS2的分辨率为 17500,二级质谱的离子注入时间为40 ms。
质谱原始文件直接由Proteome Discoverer 1.3搜索引擎进行检索,采用默认参数设置。检索数据库为UniProt Knowledgebase Release 12.6 (人库,76137 条蛋白质,该库包括UniProtKB/Swiss-Prot Release 54.6和UniProtKB/TrEMBL Release 37.6),并用该数据库生成反库。参数设置:固定修饰为半胱氨酸脲甲基化。可变修饰为甲硫氨酸氧化以及N发生+0.9840 Da的可变修饰。最多允许2个胰蛋白酶漏切位点。母离子搜索误差为±15 ppm,碎片离子误差为±20 amu。最终肽段搜库假阳性率(FDR)设置为1%[ 16 ]。对鉴定到的糖基化位点前后6个氨基酸用Motif-X软件[ 17 ](http://motif-x.med.harvard.edu/)进行出现频率特征分析。匹配的数据库选择为人库,Motif-X软件利用氨基酸所在位置叠加性计算出包括修饰位点在内的周围13个位点的出现几率,生成的结果通过IceLogo软件进行编辑生成热图[ 18 ]。
实验将ZIC-HILIC作为N-糖肽和N-糖的富集材料,分别对人血浆中N-糖链和N-糖肽展开了研究。该方案中,首先采用FASP的样品制备方法,随后将酶切肽段分成了两个部分,一部分采用优化的ZIC-HILIC富集方法对糖肽进行富集,随后用PNGase F酶切N-糖肽,并结合碱性反相色谱进行肽段的预分离和高准确度质谱分析,最终在健康人的血浆中共获得了299个糖基化蛋白、637个糖基化的位点;另一部分先用PNGase F酶进行处理,然后再用ZIC-HILIC对N-糖进行富集,最后用MALDI-TOF-TOF MS进行检测，共识别了31种不同的N-糖型,实验流程如图1所示。
本实验尝试以移液枪头作为载体,C8作为筛板制成富集柱来富集糖肽,并对筛板的吸附性、清洗次 数、洗脱次数逐一进行了考察。最终建立了一套简单、高效的亲水色谱富集糖肽的策略。
首先用5 μ g牛胎球蛋白与45 μ g BSA组成混合样品对ZIC-HILIC富集策略的可行性进行了考察,并用MALDI-TOF-TOF MS分析富集前后的肽混合物。对比发现,通过ZIC-HILIC富集后,经胰蛋白酶酶切得到的牛胎球蛋白的3个去糖基化肽段峰(m/z 1741、3017和 3672)的信号响应值大大提高,远高于其他非糖肽峰,说明利用本方法糖肽获得了较好的富集(见图2a, b)。同时,考虑到C8筛板本身可能对糖肽有吸附作用,进一步对洗脱完糖肽的富集柱用含30%ACN和0.5%FA的水溶液继续洗脱,并用PNGase F酶切,MALDI-TOF-TOF MS检测,没有发现信号峰,说明肽段在C8筛板上无吸附的肽段,如图2c所示。
清洗和洗脱条件的优化是亲水富集效果好坏的关键。以健康人血浆为样品比较了清洗和洗脱不同次数后鉴定到的肽段数量,获得最适合的清洗和洗脱条件。首先,用含80%ACN和5%FA的清洗溶液对富集柱进行清洗,每次清洗液的体积为80 μ L,比较了清洗1到8次后再进行洗脱质谱鉴定到的糖肽和非糖肽的数量。从鉴定结果可以发现,随着清洗次数的增加,糖肽与非糖肽的比值逐渐增加(从第一次清洗到第八次清洗,糖肽与非糖肽的鉴定比例分别是0.15、0.35、0.47、0.70、0.85、1.17、1.28和1.77),这说明了糖肽比非糖肽具有更好的亲水性。然而随着清洗次数的增加,虽然糖肽与非糖肽的比值逐渐增加,但是糖肽的鉴定数量也降低了,说明过多的清洗会造成糖肽的损失。在清洗第六次时,糖肽的鉴定数量最多,而随着清洗次数的进一步增加,鉴定到的糖肽数量逐渐降低(从第六次开始糖肽的鉴定数量分别为362、309和211),如图3a所示。
在本实验通过ZIC-HILIC富集后的血浆肽段中,糖肽谱图数占总谱图数的64.4% ,而没有经过富集的血浆肽段直接用PNGase F酶切后,其糖肽谱图数仅仅占总谱图数的1.8% ,说明本实验的富集方法达到了较好的富集效果。而在富集后用MALDI-TOF-TOF MS鉴定到的31种血浆糖型中,绝大多数是常见糖型,如图4所示。
由于血浆样品极其复杂,并且绝大多数的糖蛋白为低丰度表达蛋白质,为了鉴定到更多的低丰度表达蛋白质,提高N-糖肽鉴定数量,此处选用了耐高pH的反相色谱柱,并用pH 10的流动相对PNGase F酶切后的糖肽样品进行预分离。使用碱性流动相的反相色谱与使用酸性流动相的反相色谱法相比,其优点在于与第二维使用酸性流动相的反相色谱分离之间有很好的正交性[ 19 ];与强阳离子交换(SCX)色谱相比,无需脱盐,不仅可以减小工作量更重要的是减少了脱盐带来的样品损失。在该实验中,将收集到的36组样品按前中后的顺序合并成12个流分,这样既可以节省质谱的扫描时间,同时也使得数据分析的工作量大大降低。研究结果发现在合并之后的12个流分中,每个流分鉴定到的糖基化肽段的数量都很接近,说明在合并流分之后,糖肽平均分配到了每个流分之中。
为了获知富集到的糖蛋白在血浆中的丰度信息,将鉴定到的血浆糖蛋白以Farrah等[ 20 ]报道的 人类血浆蛋白质组数据为参考,发现鉴定到的多个 糖蛋白质量浓度都低于20 ng/mL (见表1)。
在所有鉴定的数据中,符合N-X-T结构的有358个,符合N-X-S结构的270个,而符合N-X-C结构的只有9个,不到总糖基化位点数量的2%(图5a)。
蛋白质的N-糖基化与多种重要的生理病理进程相关,也是很多重大疾病生物标志物研究的热点。本实验采用亲水富集结合碱性反相色谱策略对复杂样本中糖基化肽段及糖型进行富集,在健康人血浆中共鉴定到了299个N-糖基化蛋白、637个N-糖基化的位点以及31种N-糖糖型,结果表明该策略是一种较好的规模化分析血浆糖蛋白及N-糖的研究手段。在这些鉴定到的位点中有107个位点是首次 发现的,大大补充了糖蛋白数据库。而亲水色谱法 富集手段与凝集素和酰肼富集糖蛋白/糖肽相比,操作简单,价格便宜,而且不破坏糖型,具有更广泛的应用前景。
2013, Vol. 31 Issue (11): 1057-1063
PDF (1825KB)
2013, Vol. 31 Issue (11): 1057-1063
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