将1.2.1节中“加入20.0 mL乙腈、4.0 g无水MgSO₄、1.0 g NaCl”步骤改为“加入20.0 mL含1%(v/v)乙酸的乙腈、4.0 g无水MgSO₄、1.0 g无水醋酸钠”,再将“加入0.5 mL甲醇及0.5 mL水溶解”改为“加入0.5 mL甲醇及0.5 mL 0.1%(v/v)甲酸水溶液溶解”,其余与1.2.1节一致。

LC条件 Waters Atlantis^ T3色谱柱(150 mm×2.1 mm, 3 μ m);柱温30 ℃;进样体积10 μ L。流动相:A相为0.1%(v/v)甲酸水溶液(含10%甲醇), B相为含0.1%(v/v)甲酸的甲醇;梯度洗脱程序:0～3 min, 40%B; 3～23 min, 40%B～90%B; 23～25 min, 90%B; 25～26 min, 90%B～40%B; 26～46 min, 40%B。流速为0.2 mL/min。

MS/MS条件 电喷雾离子源,正离子模式;电喷雾电压为 5500 V;雾化气流速为55 mL/min；辅助气流速为55 mL/min；气帘气流速为20 mL/min；离子源温度为500 ℃；仪器工作软件为Analyst 1.5；扫描方式:按时间表的多反应监测(Scheduled MRM)^{[ 15 ]},其他条件见表1。

GC条件 HP-5 MS色谱柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μ m);载气为高纯氦气,流速为1.0 mL/min;进样口温度为290 ℃;进样量为1.0 μ L,不分流进样;柱温程序:60 ℃保持1 min,以25 ℃/min 升温至125 ℃,再以10 ℃/min 升温至300 ℃,保持5 min。

MS条件 色谱-质谱接口温度为280 ℃;电子轰击(EI)离子源温度为230 ℃；电子能量为70 eV；四极杆温度为150 ℃；全扫描(SCAN)范围:m/z 50～550。

在电喷雾离子源正离子电离模式下,以流动注射方式分别对51个农药化合物的单标准溶液进行母离子全扫描,再对各自的子离子进行全扫描,每个化合物选择2对响应值高的特征离子对作为定量及定性离子对,并进行MRM参数的优化,优化结果见表1。

杀螟丹在离子源中转化为沙蚕毒素,因此,以沙蚕毒素的准分子离子作为检测杀螟丹的特征母离子。丁硫克百威遇水分解为克百威,在酸性介质中分解更快,在本文色谱分离条件下,丁硫克百威已全部转化为克百威,因此,以克百威的准分子离子作为检测丁硫克百威的特征母离子。苯菌灵在甲醇-0.1%甲酸水溶液(1 ∶ 1, v/v)介质中部分转化为多菌灵,经色谱分离后全部转化为多菌灵,因此,以多菌灵的准分子离子作为检测苯菌灵的特征母离子。

在本文色谱条件下,以含0.1%(v/v)甲酸的甲醇溶液和0.1%(v/v)甲酸水溶液为流动相可获得较好的分离度及较高的响应值,同分异构体仲丁威和猛杀威、异丙威和3,4,5-混灭威、甜菜宁和甜菜安、禾草丹和坪草丹均能达到基线分离(保留时间见表2)。图1a为按1.2.2节进行前处理的青刀豆基质匹配混合标准溶液的提取离子色谱图,图1b为按1.2.1节进行前处理的青刀豆基质匹配混合标准溶液中二氧威的提取离子色谱图。

采用GC-MS全扫描方式分析6种蔬菜乙腈提取液的基质干扰物,通过对谱图的分析,结合NIST谱库检索,确认基质的主要干扰成分。结果表明: 不同蔬菜之间基质干扰物种类及含量不完全相同, 但主要干扰物相似,主要有4类:(1)取代酚类,最早出峰(9 min之前),一般相对分子质量(M_r)≤200; (2)脂肪酸和烯烃类,200≤M_r≤400,在中段(10～21 min)出峰;姜提取液中特有的姜辣素(主要为姜酚类和姜醇类物质)亦在此段出峰;(3)维生素E和甾类,M_r≥400,最后出峰(22 min以后);甾类主要是具有多环结构的菜油甾醇、谷甾醇和豆固醇酯;(4)色素和油脂类,如姜提取液中含有较多姜油,这两类化合物相对分子质量大,沸点高,难于气化,因此不会进入到色谱柱,无色谱峰。由图2可见,各种蔬菜提取液基质中干扰物的相对分子质量及极性差别较大。

图2

Fig. 2

图 2 基于GC-MS全扫描的6种蔬菜提取液的总离子流色谱图 Fig. 2 Total ion chromatograms of raw extracts from the six vegetables in full scan mode of GC-MS a. tomato; b. green bean; c. shallot; d. broccoli; e. ginger; f. carrot .

采用GC-MS全扫描分析6种基质提取液及经PSA、C18及C18+PSA净化后的净化液,结果显示:(1)PSA能去除或部分去除出峰较早的酚类,部分去除脂肪酸类基质干扰物;(2)C18能去除维生素E及甾类干扰物,部分去除脂肪酸及烯烃类干扰物;(3)采用C18+PSA能有效去除强极性至弱极性基质干扰物。可见,单独使用PSA或C18均不能达到有效去除基质干扰物的目的,而同时使用C18及PSA则能够有效去除宽极性范围的干扰物。PSA可通过极性相互作用及弱阴离子相互作用保留极性较强的酚类及脂肪酸类干扰物,而C18可通过非极性相互作用保留弱极性的脂肪酸类、烯烃类、维生素E、甾类、色素及油脂等大分子基质干扰物。图3为番茄提取液经PSA、C18及C18+PSA净化前后的GC-MS全扫描总离子流色谱图。

图3

Fig. 3

图 3 番茄提取液净化前后的GC-MS 全扫描总离子流色谱图比较 Fig. 3 Comparison of GC-MS (full scan) total ion chromatograms of tomato extracts before and after cleanup a. no cleanup; b. cleanup with PSA(50 mg/mL); c. cleanup with C18 (50 mg/mL); d. cleanup with C18+PSA (25 mg/mL+50 mg/mL).

对6种蔬菜乙腈提取液净化前后的蒸发残渣质量进行分析(见图4),结果表明:(1)生姜提取液中基质干扰物最多,胡萝卜次之;(2)对于番茄、青刀豆、大葱、青花菜这4种基质,PSA去除的基质干扰物比C18多；而对于生姜及胡萝卜,C18去除的基质干扰物比PSA多;(3)使用C18+PSA两者组合净化效果最好。通过进一步考察增加C18或PSA使用量对6种基质提取液的净化效果的影响,发现当使用剂量由原来每mL提取液加入50 mg吸附剂增大到75 mg及100 mg时,蒸发残渣结果显示增大使用剂量对6种基质的净化效果未见明显改善。

对以乙腈及含1%(v/v)乙酸的乙腈为溶剂的51种农药混合标准溶液,分别加入MgSO₄+PSA+C18进行d-SPE净化,而后测定各农药的浓度变化,以考察吸附剂对各种农药的吸附作用。结果显示:当以乙腈为溶剂时,MgSO₄+PSA+C18吸附剂可吸附杀螟丹、霜霉威及磺草灵;而以含1%乙酸的乙腈为溶剂时,吸附剂只吸附杀螟丹和霜霉威。其他农药均未见被吸附。由于吸附剂对部分农药有吸附作用,因此,需要尽量减少吸附剂的使用剂量。本文最终确定每mL提取液加入C18吸附剂25 mg、PSA 50 mg进行d-SPE净化,以确保净化效果及回收率。

对20 μ g/kg 添加水平的青刀豆加标样品分别采用1.2.1节、1.2.2节及1.3节方法进行回收率试验,结果显示:22种农药的回收率有差异(回收率差值＞5%),其余29种农药的回收率结果基本保持一致(回收率差值≤5%)(见图5)。

图5

Fig. 5

图 5 两种QuEChERS方法应用于农药添加水平为20 μ g/kg 的青刀豆样品的回收率比较(n=4) Fig. 5 Comparison of recoveries of two versions of QuEChERS sample preparation method for green bean sample spiked with 20 μ g/kg pesticides (n=4)

使用不加缓冲盐的QuEChERS方法时,有8种农药(乙硫苯威、杀螟丹、霜霉威、禾草敌、磺草灵、丁草敌、甲基硫菌灵、苯胺灵)的回收率低于50% , 7种农药(速灭威、苯硫威、禾草丹、禾草畏、哌草丹、苄草丹、坪草丹)的回收率在62.1% ～73.4%之间,结果劣于AOAC 2007.01方法(见图5)。在未加缓冲盐的QuEChERS方法中,涕灭威大部分转化为涕灭威亚砜,久效威亦大部分转化为久效威亚砜,而采用AOAC 2007.01方法则未见转化。硫双灭多威在两种方法中均部分转化为灭多威。二氧威在酸性条件下不稳定,采用AOAC 2007.01方法进行前处理,回收率为2.3% ,采用未加缓冲盐的QuEChERS方法,回收率为102% 。以上结果表明,AOAC 2007.01方法适用于除二氧威以外的其他50种氨基甲酸酯类农药残留的前处理。

按照本文1.2.2节方法进行前处理(二氧威按照1.2.1节方法进行前处理), 1.1节方法配制基质匹配标准溶液及纯溶剂标准溶液并制作校准曲线,则基质效应=基质匹配校准曲线斜率/纯溶剂标准曲线斜率^{[ 8, 9 ]},斜率比越接近1,则基质效应越小,比值越小则基质效应越大。结果显示,生姜的基质效应最大,胡萝卜次之(见表2)。基质效应与保留时间(t_R)有关,t_R≤3.0 min的化合物基质效应最大,t_R≥27.0 min的化合物次之;而杀螟丹与久效威因响应值低,更易受基质效应的影响。

在优化的LC-MS/MS分析条件下,51种化合物在6种蔬菜基质匹配标准溶液中的浓度与对应的峰面积呈良好线性关系,相关系数为 0.9930～0.9999。

在6种基质中各添加质量浓度分别为10、20及100 μ g/kg 的51种氨基甲酸酯类农药的混合标准溶液,应用1.2.2节方法进行样品前处理，测定回收率,每个添加水平重复测定6次。结果显示:除二氧威外50种农药的平均回收率为58.4% ～126% ,相对标准偏差(RSD)为3.3% ～26% (硫双灭多威以灭多威计^{[ 3 ]})。杀螟丹、霜霉威、丁草特、久效威、磺草灵、甲基硫菌灵这6种农药在青刀豆基质中的平均加标回收率结果见表3;其他45种农药(二氧威采用1.2.1节方法处理)的回收率在78.6% ～118% , RSD≤10% ;以10 μ g/kg 加标样品的定量离子对色谱信号,以信噪比(S/N)为3确定方法的检出限,除杀螟单及久效威的检出限(LOD)为20 μ g/kg 外,其余农药的LOD范围为0.1～3.3 μ g/kg;以S/N≥10确定方法的定量限(LOQ),除杀螟单及久效威的LOQ为50 μ g/kg 外,其余农药的LOQ范围为0.2～10 μ g/kg(见表1), 49种农药的定量限均小于或等于10 μ g/kg,符合国内外残留限量要求。

表 3 6种农药在青刀豆基质中的加标回收率和相对标准偏差(n=6)* Table 3 Recoveries (Rec) and relative standard deviations (RSDs) for six pesticides spiked at 10, 20, 100 μ g/kg in green bean (n=6)* No. Pesticide 10 μ g/kg 20 μ g/kg 100 μ g/kg Rec/% RSD/% Rec/% RSD/% Rec/% RSD/% 1 cartap 88.6 9.2 70.5 7.6 66.3 5.2 7 propamocarb 63.0 5.4 71.2 4.8 78.6 4.5 20 butylate 66.3 26 76.4 22 73.3 18 21 thiofanox 126 16 103 8.2 86.2 4.7 29 asulam 83.4 5.3 78.8 6.2 68.5 6.8 47 thiophanate-methyl 58.4 26 67.3 21 61.1 17 * Except the above 6 pesticides, the recoveries of the other 45 pesticides (see Table 1) ranged from 78.6% to 118% with RSDs less than 10% .

表 3 6种农药在青刀豆基质中的加标回收率和相对标准偏差(n=6)* Table 3 Recoveries (Rec) and relative standard deviations (RSDs) for six pesticides spiked at 10, 20, 100 μ g/kg in green bean (n=6)*

本文考察了原创QuEChERS方法及AOAC 2007.01方法对蔬菜中51种氨基甲酸酯类农药提取的适用性,结果表明,AOAC 2007.01方法适用于蔬菜中50种氨基甲酸酯类农药残留的测定,二氧威残留在未加缓冲盐的QuEChERS方法中能获得满意结果。优化了净化方法,确定采用C18+PSA两种固相吸附剂进行分散固相萃取可获得较好的净化效果,从而降低基质效应,提高方法的回收率及重现性,减少仪器污染。在此基础上,建立了6种蔬菜中的51种氨基甲酸酯类农药残留的LC-MS/MS测定方法,该法灵敏、有效,适用于蔬菜中51种氨基甲酸酯类农药残留的定性定量分析。