近年来,由于植物生长调节剂使用不当引起的食品安全问题逐渐增多。植物生长调节剂对植物的生长发育有调节作用,如多效唑能够提高果树产量[ 1 ],氯吡脲能够改善果实品质[ 2 ],异戊烯腺嘌呤除了能够提高产量和改善品质外还能增加瓜果含糖量[ 3 ], 6-苄氨基嘌呤能用于瓜果的防腐保鲜[ 4, 5 ]等。但当它们过量施用时,所产生的副作用却往往会大大超过“正”作用,打乱使用者身体的正常机理并损害健康。
我国规定多效唑在苹果中的最高残留限量为0.5 mg/kg[ 6 ];日本厚生省规定其在常食用瓜果中的最高残留限量在0.01～1 mg/kg 之间(梨中最高残留限量可达1 mg/kg)[ 7 ]。我国规定氯吡脲在黄瓜、西瓜和甜瓜中的最高残留限量为0.1 mg/kg,而奇异果和葡萄中仅为0.05 mg/kg[ 6 ];美国规定其在樱桃、蓝莓、番石榴、梨、李和蔓越橘中的最高残留限量为0.01 mg/kg,奇异果中为0.04 mg/kg,葡萄中为0.06 mg/kg[ 8 ];澳大利亚规定其在蓝莓、葡萄、奇异果、芒果和李子中为0.01 mg/kg[ 8 ]。我国国家标准规定食品中6-苄氨基嘌呤最高残留限量为0.2 mg/kg[ 9 ]。
目前多效唑、氯吡脲、异戊烯腺嘌呤和6-苄氨基嘌呤的检测方法主要有高效液相色谱法[ 10, 11, 12, 13 ]和高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[ 14, 15, 16 ],对于多效唑也有采用气相色谱-串联质谱技术[ 2, 17, 18 ]的报道。但色谱法仅依靠保留时间对目标化合物进行定性分析,容易产生漏检(假阳性或假阴性),可靠性不如质谱检测器;串联质谱技术则具有定性准确、检测灵敏度高、抗干扰能力强等优点,已经逐渐成为农药残留分析发展的新趋势[ 19 ]。对于植物生长调节剂的残留量检测,常见检测单独某一种植物生长调节剂的报道[ 1, 5, 20 ],同时检测多种植物生长调节剂的报道并不多见[ 21 ]。本研究建立了有机溶剂提取结合阳离子交换固相萃取柱净化和LC-MS/MS方法,检测瓜果中多效唑、氯吡脲、异戊烯腺嘌呤和6-苄氨基嘌呤4种植物生长调节剂,具有较高的灵敏度和良好的稳定性。
仪器:Agilent 1290高效液相色谱系统,配自动进样器(美国Agilent公司); API 5500 Q-TRAP四极杆串联线性离子肼质谱仪(美国AB公司);固相萃取仪(美国Supelco公司); N-EVAP氮吹仪(美国Organomation公司); Allegia X-22R高速冷冻离心机(Beckman公司)。
试剂:乙腈、甲醇、正己烷(色谱纯,美国Merck公司);甲酸(ACS纯,J. T. Baker公司);乙酸铵(ACS纯,Fisher公司);氨水(色谱纯,上海国药集团化学试剂有限公司);实验用水为超纯水(Mili-Q, Millipore公司)。
标准品:多效唑(paclobutrazol)、氯吡脲(forchlorfenuron)、异戊烯腺嘌呤(isopentennyladenine)和6-苄氨基嘌呤(6-benzylaminopurine)购自Dr. Ehrenstorfer公司,纯度均大于99% 。4种植物生长调节剂混合标准储备溶液和工作液的配制:准确称取适量的4种植物生长调节剂标准品,用乙腈配制质量浓度为10 mg/L 的标准储备液;再用乙腈稀释至质量浓度分别为多效唑50 μ g/L、氯吡脲5 μ g/L、异戊烯腺嘌呤2 μ g/L 和6-苄氨基嘌呤20 μ g/L 的混合标准工作液。以上溶液均置于4 ℃冰箱中保存。
材料:Poly-Sery MCX混合型阳离子交换固相萃取小柱(60 mg, 3 mL,德国CNW公司); 0.22 μ m有机相滤膜(上海安谱科学仪器有限公司);瓜果样品购自上海农贸市场。
准确称取2.0 g(精确至0.01 g)已经均质的瓜果样品于50 mL塑料离心管中,加入10 mL乙腈溶液,漩涡混合提取2 min,于 4000 r/min 离心5 min,转移上清液于梨形瓶中。残渣中加入10 mL乙腈,按上述步骤再提取一次。合并两次上清液,旋转蒸发至近干,以2 mL超纯水复溶。
Poly-Sery MCX固相萃取柱依次用4 mL甲醇、4 mL超纯水活化,将1.2.1节中的复溶液过柱,流速控制在约1滴/秒;依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗,抽真空后以4 mL氨水-甲醇溶液(5 ∶ 95,如无特殊说明均为体积比)进行洗脱。收集洗脱液,氮吹浓缩至近干;用1 mL乙腈-水(1 ∶ 1)定容,过0.22 μ m有机相滤膜后供液相色谱-质谱仪测定。
色谱柱:Agilent XDB-C18色谱柱(4.6 mm×50 mm, 1.8 μ m);流动相A: 5 mmol/L 乙酸铵水溶液,流动相B:含0.1%(如无特殊说明均为体积分数)甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱程序: 0～2.0 min, 2%B; 2.1～5.5 min, 2%B～99%B; 5.5～11.0 min, 99%B; 11.0～11.1 min, 99%B～2%B; 11.1～14 min, 2%B。进样量:10 μ L;流速:0.3 mL/min;柱温:30 ℃。
离子源:电喷雾离子源(ESI),采用ESI+模式;扫描方式:多反应监测(MRM);电喷雾电压(IS): 5500 V;雾化器(GS1)压力: 3.4474×105 Pa;气帘气(CUR)压力: 1.7237×105 Pa;辅助气(GS2)压力: 3.4474×105 Pa;离子源温度(TEM): 450 ℃;碰撞活化离解(CAD):中等;扫描时间:0.1 s。4种植物生长调节剂的保留时间、所选择的特征离子等MRM参数见表1。
本方法所检测的4种植物生长调节剂，其化学结构中均含有氨基,易溶于乙腈、甲醇等极性溶剂,在水溶液中呈弱碱性。因此，乙腈因其极性大、穿透力强、提取效率高等特性被选定为本研究的提取溶剂[ 15 ]。
研究比较了CNW Poly-Sery MCX、SUPELCO PP、CNWBOND GCB和SUPELCO ENVI-CARB等4种固相萃取柱。结果发现Poly-Sery MCX柱对4种目标化合物的回收效果均较为理想,另3种固相萃取柱仅对多效唑有较好的回收效果。因此选定Poly-Sery MCX固相萃取柱对目标化合物进行净化。
比较了含不同比例氨水的甲醇溶液对目标化合物的洗脱效果。结果发现氨水-甲醇的体积比为5 ∶ 95和10 ∶ 90时回收率相当；20 ∶ 80时氯吡脲的回收率有所降低。可能原因是氨水含量越高,所需氮气流吹干时间越久,使得目标化合物有所损失,因此选定洗脱液为氨水-甲醇(5 ∶ 95)溶液。进而比较洗脱液体积为1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 mL时的洗脱效果,结果表明4 mL氨水-甲醇(5 ∶ 95)溶液可将目标化合物洗脱完全,因此收集前4 mL洗脱液作为样品溶液。
根据4种植物生长调节剂的结构可知其属于碱性化合物,采用正离子模式进行质谱检测可获得较高的灵敏度;由于其结构中含有可离子化的氨基,故采用5 mmol/L 的乙酸铵水溶液和含0.1%甲酸的乙腈溶液为流动相,可以促进目标化合物的保留、分离并能改善峰形。对流动相的比例和梯度洗脱程序进行了优化, 结果表明采用1.3.1节所述的流动相组成和梯度洗脱程序可得到较好的峰形和分离效果。
本研究涉及的4种植物生长调节剂属于弱碱性化合物,适宜采用正离子模式进行检测。在正离子模式下,采用流动注射的方式对100 μ g/L 的植物生长调节剂标准溶液进行母离子全扫描,确定各物质的分子离子[M+H]+。然后分别以[M+H]+为母离子,对其子离子进行全扫描。选取丰度较强、干扰较小的两对子离子为定性和定量离子,进而对去簇电压、碰撞电压等质谱参数进行优化,结果见表1。
分别配制系列基质匹配标准溶液,以峰面积Y对质量浓度X( μ g/L)作图,4种植物生长调节剂在各自浓度范围内线形关系很好,相关系数(r)均大于0.999。多效唑、氯吡脲、异戊烯腺嘌呤和6-苄氨基嘌呤的定量限(S/N＞10)在0.04～1.35 μ g/kg 之间,检出限(S/N＞3)在0.01～0.41 μ g/kg之间,详见表2。各国对多效唑的最高残留限量范围在0.01～0.5 mg/kg 之间,氯吡脲在0.01～0.1 μ g/kg 之间,6-苄氨基嘌呤为0.2 μ g/kg,因此本研究可充分满足实际应用要求。
以黄瓜和苹果为瓜果的代表性样品基质,在3个添加水平进行回收率试验,每个添加水平进行8次重复试验,结果见表3。这4种植物生长调节剂在黄瓜和苹果中的回收率范围分别为82.5% ～92.7%和81.0% ～93.3% ,相对标准偏差(RSDs)分别为2.7% ～9.9%和3.5% ～9.5% ,符合残留分析要求。最低添加水平的苹果样品的多反应监测色谱图见图1。
应用本研究所建立的方法,对市售黄瓜、苹果、葡萄、菠萝和李子5种瓜果进行了检测,在黄瓜、苹果和葡萄样品中检出异戊烯腺嘌呤的残留,含量分别为0.22 mg/kg、0.05 mg/kg 和0.58 mg/kg,其中葡萄中残留量较高,但未检测出另3种植物生长调节剂的残留。可见该5种市售瓜果在植物生长调节剂的使用方面较为合理。
本研究采用乙腈提取、阳离子交换固相萃取柱净化、高效液相色谱-串联质谱检测，可同时测定瓜果中4种植物生长调节剂的残留量。该方法简便、准确、灵敏，可满足相关残留检测的需求。
2013, Vol. 31 Issue (10): 1016-1020
PDF (1442KB)
2013, Vol. 31 Issue (10): 1016-1020
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