色谱  2013, Vol. 31 Issue (11): 1129-1133   PDF (1131KB)    
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徐小民
何华丽
阮宇迪
黄百芬
张京顺
蔡增轩
任一平
气相色谱-三重四极杆串联质谱法同时测定调味品中的氨基甲酸乙酯和氯丙醇
徐小民1, 何华丽2, 阮宇迪2, 黄百芬1, 张京顺1, 蔡增轩1, 任一平1     
1. 浙江省疾病预防控制中心, 浙江 杭州 310051;
2. 浙江工业大学化学工程与材料科学学院, 浙江 杭州 310014
收稿日期：2013-06-03
基金项目：浙江省分析测试基金项目(04016);浙江省重点科技创新团队计划项目(2011R50021).
通讯作者：任一平,Tel(0571)87115261,E-mail:renyiping@263.net.
摘要：建立了气相色谱-三重四极杆串联质谱(GC-MS/MS)同时测定调味品中氨基甲酸乙酯(EC)和氯丙醇(3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)和2-氯-1,3-丙二醇(2-MCPD))的方法。样品添加同位素内标后,采用ExtrelutTM NT有机硅藻土填料进行基质固相分散萃取,先用正己烷淋洗除杂,再用乙酸乙酯-乙醚(20:80, v/v)混合溶剂洗脱被测物,洗脱液经浓缩后采用GC-MS/MS多反应监测(MRM)模式测定。EC、3-MCPD和2-MCPD的方法检出限依次为2、5和5 μg/kg,线性范围依次为5~1000 μg/kg(r=0.9997)、10~1000 μg/kg(r=0.9991)和10~1000 μg/kg(r=0.9995)。酱油、料酒(黄酒)、沙拉酱和方便面调味料4种基体中在20、100和400 μg/kg 3个水平加标测定的平均回收率和相对标准偏差(RSD,n=7)范围分别为EC: 87.7%~104%(RSD为4.3%~10.7%)、3-MCPD: 90.1%~109%(RSD为2.6%~10.2%)、2-MCPD: 90.9%~103%(RSD为3.0%~9.5%)。在部分酱油、料酒和方便面调味料中同时检测到了EC、3-MCPD和2-MCPD,在部分沙拉酱中检测到了EC或3-MCPD。该法准确、快速,适用于调味品中EC、3-MCPD和2-MCPD的同时检测。
关键词： 气相色谱-三重四极杆串联质谱     同位素内标法     氨基甲酸乙酯     氯丙醇     调味品    
Simultaneous determination of ethyl carbamate and chloropropanols in flavorings by gas chromatography- triple quadrupole tandem mass spectrometry
XU Xiaomin1, HE Huali2, RUAN Yudi2, HUANG Baifen1, ZHANG Jingshun1, CAI Zengxuan1, REN Yiping1     
1. Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310051, China;
2. College of Chemical Engineering and Materials Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China
Received: 2013-06-03
Abstract: A simultaneous determination method for ethyl carbamate (EC) and chloropropanols (3-monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD) and 2-monochloropropane-1,3-diol (2-MCPD)) in flavorings was developed by gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry (GC-MS/MS). After spiked with internal standard, the sample was extracted by matrix solid-phase dispersion extraction technique with an ExtrelutTM NT column. Hexane was used to wash the fat soluble matrix interferences and then an ethyl acetate-ethyl ether (20:80, v/v) mixture was added to elute the analytes. The concentrated extract was detected by GC-MS/MS in multiple reaction monitoring (MRM) mode. The limits of detection (LODs) were 2, 5 and 5 μg/kg for EC, 3-MCPD and 2-MCPD, respectively. The linear ranges were 5-1000 μg/kg (r=0.9997), 10-1000 μg/kg (r=0.9991) and 10-1000 μg/kg (r=0.9995) for EC, 3-MCPD and 2-MCPD, respectively. In soy sauce, yellow rice wine, salami sauce and flavoring of instant noodle matrices, the recoveries (RSDs, n=7) in MRM mode at the levels of 20, 100 and 400 μg/kg were 87.7%-104% (4.3%-10.7%), 90.1%-109% (2.6%-10.2%), and 90.9%-103% (3.0%-9.5%), respectively. EC, 3-MCPD and 2-MCPD were found in some real samples of the soy sauce, wine and flavoring of instant noodle. EC or 3-MCPD was found in some of the salami samples. The method is accurate, fast and suitable for the simultaneous determination of EC, 3-MCPD and 2-MCPD in flavorings.
Key words: gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry (GC-MS/MS)     isotope labeled internal standard     ethyl carbamate     chloropropanols     flavorings    
氨基甲酸乙酯(EC)是食品发酵过程中产生的副产物,主要存在于酒类、酿造酱油、面包等发酵类食品[ 1, 2, 3, 4 ]中。食品中的氯丙醇(3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)和2-氯-1,3-丙二醇(2-MCPD))主要来自于酸水解植物蛋白液[ 5 ],此类水解蛋白液主要作为风味原料被添加于配制酱油、沙拉酱、方便面调味料等调味品中,自然发酵的食品也能产生微量的3-MCPD,含量低于20 μ g/kg[ 6 ]。这两类有害物质有可能同时存在于调味品中。EC被国际癌症研究机构(IARC)于2007年评定为2A类对人类可能的致癌物[ 1 ], 3-MCPD虽然已经被证明没有致癌作用,但长期低剂量的摄入可能损害肾功能和影响精子的活性[ 5 ]。酱油和料酒是我们日常食用的调味品,而方便面则是当前亚洲年轻人所钟爱的主食之一,有些儿童和青少年甚至把它作为早餐或零食。研究这两类有害物质在调味品中的污染水平,以帮助指导合理饮食、控制膳食摄入风险,快速准确地多组分同时检测技术的开发是其中的关键。

由于这两类物质属于极性小分子化合物,且缺乏适合光谱分析的官能团,给复杂基体中的定性确证带来困难,因此衍生化技术成为此类物质准确定性和定量的首选方法,如EC的9-羟基吨衍生化-液相色谱-荧光检测法[ 7, 8 ]和液相色谱-串联质谱检测法(LC-MS/MS)[ 9 ], 3-MCPD的七氟丁酰咪唑[ 5, 10 ]、七氟丁酸酐[ 11 ]和苯硼酸[ 12 ]等的衍生化-气相色谱-质谱联用法(GC-MS)。由于官能团的差异,很难找到同时适合这两类化合物的衍生试剂,所以非衍生化直接检测法是开发同时检测技术的突破口。EC的GC-MS直接检测方法文献报道较多[ 13, 14, 15 ],但是因为其特征离子较小,复杂基体中低浓度时的定性确证存在争议[ 4 ],有文献报道采用气相色谱-三重四极杆串联质谱法(GC-MS/MS)[ 16 ]和LC-MS/MS[ 17 ]来解决此类问题。因为基质的干扰,文献报道复杂基体中3-MCPD的非衍生化GC-MS检测只能做到100 μ g/kg 以上[ 5 ],痕量水平3-MCPD的LC-MS/MS检测法则未见报道。总结文献和多年的工作积累,本工作采用基质固相分散萃取技术来净化和提取、GC-MS/MS同时检测调味品中的EC、3-MCPD和2-MCPD。



1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

7890 GC-7000B MSD气相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(美国Agilent公司)，配电子轰击(EI)离子源。EC(纯度:98% ,日本TCI公司); EC-d5(纯度:98% ,美国CIL公司); 3-MCPD(纯度:99% ,美国Sigma-Aldrich公司), 2-MCPD(纯度:99% ,加拿大Toronto Research Chemicals公司), 3-MCPD-d5(纯度:99% ,德国Dr. Ehrenstorfer公司); ExtrelutTM NT有机硅藻土散装填料(德国Merck公司);甲醇、乙醚、乙酸乙酯和正己烷(HPLC级,美国TEDIA公司);无水硫酸钠(分析纯,上海试四赫维化工有限公司,使用前经500 ℃干燥8 h)。

分别用甲醇配制质量浓度为 1000 mg/L 的单一标准(或内标)储备溶液;用甲醇配制质量浓度为5 mg/L 的EC-d5和3-MCPD-d5混合内标使用液;用乙酸乙酯配制质量浓度为5、10、20、50、100、200、500、1000 μ g/L 的EC、3-MCPD和2-MCPD系列混合标准溶液,每个浓度水平的标准溶液均含有250 μ g/L 的内标。

1.2 样品处理

对于本身就比较均匀的酱油、料酒和沙拉酱等样品,可以混匀后直接取样,对于方便面调味料,应至少取5个方便面包装中的调味料,将里面的粉包、油包和酱包等调味包全部倒入搅拌机中搅拌均匀后取样。

液体含水样品(如酱油、料酒等):称取约1 g(准确至0.001 g)样品于5 mL试管中,准确加入50 μ L质量浓度为5 mg/L 的内标使用液,混匀后转移至装有1.5 g ExtrelutTM NT填料的玻璃固相萃取柱中(15 cm×1.2 cm,底部加有约1 cm高的无水硫酸钠),静置15 min使其分散吸附完全,用15 mL正己烷淋洗并弃去,再用15 mL的乙酸乙酯-乙醚(20 ∶ 80, v/v)混合溶剂洗脱被测物,收集的洗脱液在30 ℃氮气流下吹至约1 mL (不可以吹干),最后用乙酸乙酯定容到1 mL供仪器测定。

固体、半固体样品(如沙拉酱、方便面调味料等):称取0.5 g(准确至0.001 g)样品于25 mL小烧杯中,准确加入25 μ L质量浓度为5 mg/L 的内标使用液和1 mL纯水,用玻璃棒拌匀,加入1 g ExtrelutTM NT填料,继续拌匀使其充分固相分散,静置15 min后,将吸附了样品基质的填料转移到预先装有0.5 g ExtrelutTM NT填料的玻璃固相萃取柱中(15 cm×1.2 cm,底部加有约1 cm高的无水硫酸钠),之后的操作同液体含水样品,样品进样前定容到0.5 mL。

1.3 色谱-质谱条件

色谱柱:Innowax (30 m×0.25 mm×0.25 μ m,聚乙二醇交联键合固定相,J&W,美国Agilent公司);柱温程序:50 ℃保持3 min,以10 ℃/min 速率升温至170 ℃,再以40 ℃/min 速率升温至250 ℃,保持5 min;进样口和接口温度分别为240 ℃和250 ℃;载气(He): 1 mL/min;不分流进样1 μ L。离子源和四极杆温度分别为300 ℃和150 ℃,淬灭气(He)和碰撞气(N2)流量分别为2.25 mL/min 和1.5 mL/min,溶剂延迟时间为10 min,多反应监测模式(MRM)。监测离子对:EC: m/z 62/44(25 eV,定量离子对), m/z 62/45(25 eV); 3-MCPD: m/z 79/43(8 eV,定量离子对), m/z 81/43(8 eV); 2-MCPD: m/z 62/27(12 eV,定量离子对), m/z 64/27(12 eV);内标EC-d5: m/z 64/44(25 eV,定量离子对), m/z 64/45(25 eV)，用于定量校正EC;内标3-MCPD-d5: m/z 82/46(8 eV,定量离子对), m/z 84/46(8 eV),用于定量校正3-MCPD和2-MCPD。

2 结果与讨论
2.1 质谱检测

EC单级质谱的特征离子主要包括m/z 62、74、44、45和89,其中m/z 74、44和45存在较大的基体干扰,而m/z 89的丰度不到基峰离子m/z 62的3% ,虽然可以利用m/z 62这个干扰较少的特征离子达到低于5 μ g/kg 的检出限,但其他离子要达到准确定性,则含量必须要达到20 μ g/kg[ 18 ]。3-MCPD的特征离子主要包括m/z 79、81和61, 2-MCPD的特征离子主要包括m/z 62和64,采用单级质谱法,即使是100 μ g/kg 浓度水平的样品也很难被检出[ 5 ]。较小的特征离子给复杂基体中痕量被测物的定性确证带来了困难,而基体的干扰也使得其很难得到较好的信噪比。实验中采用串联质谱方法能有效抑制基体的干扰,即使是在酱油等复杂基体中也能得到较清晰的色谱图(见图1)。


2.2 前处理条件

EC、3-MCPD和2-MCPD均易溶于水,这使得其很难与样品基体中的水和其他水溶性组分分离。利用ExtrelutTM NT填料的强吸水性能,可以将液体含水样品基体直接上样使其分散于固相萃取柱中。淋洗时先用正己烷洗涤以除去脂溶性物质,之后用中等极性的乙酸乙酯-乙醚(20 ∶ 80, v/v)混合溶剂洗脱被测物,强极性的样品基体如水、多元醇、色素和蛋白质等仍然留在净化柱中。

实验中对乙酸乙酯和乙醚混合洗脱溶剂的比例和用量进行了优化,当混合溶剂中乙酸乙酯的用量超过25%(v/v)时,样品中极性较大的杂质洗脱较多,干扰EC的仪器测定,最终选择混合溶剂的体积比为乙酸乙酯-乙醚(20 ∶ 80)。选用此混合溶剂,依次用4份5 mL混合溶剂淋洗,分别收集并绘制洗脱曲线,发现EC在前面的10 mL中洗脱完全,而3-MCPD和2-MCPD要用15 mL的洗脱液,所以最终确定洗脱溶剂的用量为15 mL。

对于固体、半固体样品,加水是为了溶胀样品基质、溶解被测物并帮助样品基质分散到固相填料中。调味品既有富含水的酱油和料酒、也包括同时含水和油脂的沙拉酱和方便面调味包等,采用基质固相分散的方法,只用一步就能完成提取和净化的全过程,且不需要离心等操作。

因为被测物都具有一定的挥发性,所以样品提取液在氮吹时不可吹干,否则将导致实验失败。

2.3 方法学验证

取EC、3-MCPD和2-MCPD含量约为10 μ g/kg 的3个阳性样品,根据三倍信噪比确定检出限(LOD),得到EC、3-MCPD和2-MCPD在MRM模式下的LOD分别为2、5和5 μ g/kg。

将系列混合标准溶液进样，得到EC、3-MCPD和2-MCPD的线性范围依次为5～1000 μ g/kg(r=0.9997)、10～1000 μ g/kg(r=0.9991)、10～1000 μ g/kg(r=0.9995)。

在酱油、料酒(黄酒)、沙拉酱和方便面调味料4种基体中添加EC、3-MCPD和2-MCPD标准品,每个水平平行做7个样品,在20、100和400 μ g/kg 3个水平的加标回收率和相对标准偏差(RSD)范围分别为87.7% ～104%(RSD为4.3% ～10.7% )、90.1% ～109%(RSD为2.6% ～10.2% )、90.9% ～103%(RSD为3.0% ～9.5% )，详细数据见表1。

表 1 不同基体中EC、3-MCPD和2-MCPD的回收率和相对标准偏差(RSD)(n=7) Table 1 Recoveries and RSDs of EC, 3-MCPD and 2- MCPD in different matrices (n=7)
2.4 样品分析

检测了采自杭州和绍兴地区超市和农贸市场的多种样品，其中软包装料酒12份、黄酒43份、葡萄酒8份、啤酒8份、酱油52份、方便面30份、沙拉酱4份。结果在大部分料酒、黄酒、葡萄酒、啤酒中只检测到EC,没有检测到3-MCPD和2-MCPD。其中啤酒和葡萄酒中的EC含量均低于40 μ g/kg,黄酒中EC的含量在15.6～516 μ g/kg ,少部分料酒中检测到了少量的3-MCPD,含量在5.5～9.2 μ g/kg；低含量的3-MCPD有可能是酒类食品在发酵中自然产生的。在部分沙拉酱中检测到EC(含量低于7.6 μ g/kg)或3-MCPD(含量低于8.0 μ g/kg),可能来自于沙拉酱中的一些发酵类食品原料或风味添加剂。在部分酱油、方便面调味料中同时检测出了EC、3-MCPD和2-MCPD，其中，酱油中EC、3-MCPD和2-MCPD的含量分别为2.4~112、5.8~4390和5.0~811 μ g/kg，方便面调味料中的含量分别为2.2~21.5、7.3~255和5.3~106 μ g/kg。

值得关注的是,根据EC、3-MCPD和2-MCPD的结果可以判断酱油的制作工艺。EC是酱油发酵过程的副产物,纯酿造酱油中必然存在EC,不存在或只存在痕量水平的3-MCPD (低于20 μ g/kg)[ 6 ];本实验室近10年的监测数据也表明纯酿造酱油中3-MCPD的含量低于15 μ g/kg, 2-MCPD则未检出。3-MCPD和2-MCPD主要来自于酸水解植物蛋白,此水解产物主要用作配制酱油的风味原料,实验中在此类酸水解植物蛋白液中未检测到EC,但检测到了高含量的3-MCPD,文献[ 5 ]报道的酸水解液中3-MCPD含量甚至超过了10000 μ g/kg。 除了上述纯酿造酱油和全配制酱油两种产品,实验中还发现包含酿造和酸水解调味液的配制酱油,如图1样品中同时检测到了EC、3-MCPD和2-MCPD,且3-MCPD含量达到了32.7 μ g/kg。图2是另一个有代表性的酱油样品结果图,此样品中检测到了EC(10.2 μ g/kg),未检出3-MCPD,按上述分析此样品应该属于纯酿造,但是在图中还出现了较高浓度的2-MCPD(153 μ g/kg)。

图 1 酱油样品中EC (9.6 μ g/kg)、3-MCPD (32.7 μ g/kg)和2-MCPD (5.0 μ g/kg)在MRM模式下的色谱图 Fig. 1 Chromatograms of EC (9.6 μ g/kg), 3-MCPD (32.7 μ g/kg) and 2-MCPD (5.0 μ g/kg) in a soy sauce sample in MRM mode
传统工艺生产的酸水解植物蛋白液中3-MCPD与2-MCPD的含量比约为10 ∶ 1[ 5 ],在项目组之前的研究中发现随着生产工艺的改变,可以使3-MCPD在弱碱性条件下高温降解,但是2-MCPD在此条件下比3-MCPD稳定,使得此工艺生产的酸水解植物蛋白液中的2-MCPD含量比传统的高,有的甚至只有2-MCPD而没有3-MCPD[ 19 ],因此判断图2样品也是部分酿造酱油和酸水解蛋白液配制而成的。
图 2 另一酱油样品中EC (10.2 μ g/kg)、3-MCPD (未检出)和2-MCPD (153 μ g/kg)在MRM模式下的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of EC (10.2 μ g/kg), 3-MCPD (not detected) and 2-MCPD (153 μ g/kg) in another soy sauce sample in MRM mode
3 结语

本工作开发了EC、3-MCPD和2-MCPD这3种结构和性质不同的极性小分子有害物质在复杂基体中同时检测的技术，该方法能节省时间和成本,在研究食品中有害物质的形成以及食品中EC、 3-MCPD、2-MCPD的含量水平等方面起到事半功倍 的效果。其检测结果还可以为辨别纯酿造酱油和配制酱油提供依据。

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