目前双稠吡咯啶类生物碱的检测方法主要是液相色谱法。其中常用的检测器包括紫外检测器[ 4, 5 ]以及质谱检测器[ 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ]。由于PAs是双稠吡咯啶环的氨基醇和不同的有机酸两部分缩合形成,无共轭体系,紫外吸收不强。尽管高效液相色谱-紫外检测法可以对PAs进行测定,但是检测灵敏度较低,抗干扰能力弱,不能完全满足检测需求。相比其他检测方法,高效液相色谱-串联质谱法具有定性和定量准确等特点,已广泛应用于各类生物碱的检测[ 12, 13 ]。国外已有研究各类植物[ 5, 6, 7, 8 ]和蜂蜜[ 9, 10, 11 ]中双稠吡咯啶类生物碱的检测方法,但国内相应的研究除了基本的毒性报道之外,还没有对应的检测方法报道。本文建立了蜂蜜中5种双稠吡咯啶类生物碱的检测方法,并对国内8种天然蜂蜜和新西兰、西班牙和澳大利亚等国家的3种蜂蜜中5种双稠吡咯啶类生物碱的含量进行测定,为监管部门有效监控产品质量提供了技术和数据支持。
高效液相色谱仪(Agilent 1200,美国Agilent公司),三重四极杆串联质谱联用仪(API4000,美国AB公司);高纯水发生器(ELGA-Q15,英国ELGA公司);涡旋混合器;固相萃取装置;氮吹浓缩装置。
双稠吡咯啶类生物碱标准品:野百合碱(monocrotaline)、克氏千里光宁(senkirkine)、倒千里光碱(retrorsine)、千里光菲啉(seneciphylline)、千里光宁(senecionine),纯度均为99% ,德国Dr. Ehrenstorfer公司。乙腈、甲酸、醋酸铵为色谱纯,购自德国Merck公司;甲醇、氨水和盐酸为分析纯;试验用水均为去离子水。强阳离子固相萃取柱(Oasis MCX, 3 mL/60 mg,美国Waters公司)。国产蜂蜜样品来自中国8个省及自治区,进口蜂蜜来自新西兰、西班牙和澳大利亚。
分别称取5种双稠吡咯啶类生物碱标准品各10 mg于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解,配制成1 g/L 的标准储备液,密封保存于4 ℃冰箱中。再分别准确吸取1 g/L 的5种单标准储备液各1 mL于100 mL容量瓶中,用甲醇定容得10 mg/L 的混合标准溶液。使用时用初始流动相将混合标准溶液稀释成系列浓度的标准溶液,待测。
准确称取2.0 g样品于50 mL带盖聚四氟乙烯离心管中,加入10 mL 0.1 mol/L 盐酸,涡旋混合均匀。Oasis MCX固相萃取柱预先用3 mL甲醇和3 mL水活化,将样品溶液以小于1 mL/min 的流速过柱,依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗,加入5 mL 5%(如无特殊说明均为体积分数)氨水甲醇溶液洗脱。收集的洗脱液于40 ℃下用氮气吹干,用2.0 mL乙腈-水(25 ∶ 75, v/v)溶液溶解,过0.45 μ m有机和水相滤膜后供HPLC-MS/MS分析测定。
色谱柱为Phenomenex Kinetex C18(100 mm×4.6 mm, 2.6 μ m)。流动相A为0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸铵水溶液,流动相B为乙腈。流动相梯度:0～3 min, 10%B; 3～4.5 min, 10%B～90%B; 4.5～10 min, 90%B; 10～11 min, 90%B～10%B; 11～13min, 10%B。流速0.50 mL/min;进样量5 μ L;柱温30 ℃。
扫描方式:电喷雾正离子模式(ESI+);检测方式:多反应监测(MRM);喷雾电压:4500 V;去簇电压:80 V;气帘气压强:69 kPa;碰撞气压强:34.5 kPa;去溶剂温度:500 ℃;雾化气压强:345 kPa;辅助气压强:345 kPa; 5种双稠吡咯啶类生物碱的质谱检测详细参数见表1。
分析比较了乙腈-水、乙腈-5 mmol/L 乙酸铵溶液、乙腈-0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸铵溶液作为流动相时5种PAs的保留和峰形。结果表明,流动相中加入适量乙酸铵有助于5种PAs化合物的色谱保留,但峰形会略微拖尾。而随着少量甲酸的加入,5种PAs的保留时间均有所提前且峰形更对称。同时,正离子模式下加入少量的酸有利于目标化合物的离子化,使灵敏度提高10% ～20% 。
分析中对常规碳十八分析色谱柱Varian Polaris(填料粒径5 μ m)和超高效碳十八分析色谱柱Phenomenex Kinetex(填料粒径2.6 μ m)进行了比对,发现超高效分析色谱柱由于柱效高,可以有效消除某些特种蜂蜜(如洋槐)中的干扰,由于分析物只有5种(10个离子通道),在不分段扫描的情况下每个峰的扫描点数可以达到15个,满足定量需要。因此选用超高效碳十八分析色谱柱Phenomenex Kinetex，典型的蜂蜜基质加标色谱图见图1。
质谱分析中采用最为常用的电喷雾电离源(ESI)对5种PAs进行去簇电压、碰撞能量、喷雾气流量的优化,分别选取信号强度最强的两个离子碎片作为定性和定量离子。尽管有文献[ 11 ]报道,对于双稠吡咯啶类生物碱,使用大气压化学电离源(APCI)比使用ESI在24 h不间断分析中信号更稳定。但实际分析中发现12 h连续进样,使用ESI时信号峰面积变化不超过15% ,可以满足残留分析的精度要求。
在酸性条件下,双稠吡咯啶类生物碱的叔氨基团容易形成阳离子,可采用强阳离子固相萃取柱(Waters Oasis MCX)进行富集和净化。通过标准溶液(100 μ g/L)过柱试验,5种PAs的回收率均能达到85%以上。同时,使用改性聚合物固相萃取柱(Waters Oasis HLB, 60 mg/3 mL)进行对比, 以pH 9的磷酸盐缓冲溶液为上样溶液,以水淋洗,甲醇洗脱。结果发现野百合碱的回收率低于60% 。造成回收率偏低的原因为野百合碱水溶性较好,在完全依靠范德华力为保留机理的反相固相萃取柱上保留较弱,容易产生穿透而造成损失。在实际样品分析中发现进口麦努卡等品种蜂蜜在进行阳离子交换富集净化中容易出现堵塞情况,而中国蜂蜜则相对不容易堵塞固相萃取柱。导致这种情况的原因在于进口蜂蜜中蛋白质和花粉含量一般都高于中国蜂蜜。为避免出现堵塞的情况,应在过柱之前进行高速离心(6000 r/min),过定性滤纸后再进行固相萃取净化。用强阳离子固相萃取柱对1、20和50 μ g/kg 共3个添加水平的11种蜂蜜进行富集和净化,回收率和精密度均可达到满意的效果(见表2)。
按1.2节方法制备10 mg/L 的5种双稠吡咯啶类生物碱标准储备液,用乙腈-水(10 ∶ 90, v/v)稀释,依次得到质量浓度分别为1、5、10、20、50、100 μ g/L 的标准溶液。按优化后的仪器条件测定,外标法定量。以5种PAs特征离子的质量色谱峰面积为纵坐标y,质量浓度为横坐标x,绘制标准曲线。5种PAs的相关系数(r)均大于0.99,表明5种PAs在1～100 μ g/L 范围内线性关系良好。以信噪比(S/N)大于10且回收率和精密度较好的浓度点确定定量限(LOQ)，5种PAs的LOQ为1.0 μ g/kg。分别对江苏油菜蜜、河南荆条蜜、新疆葵花蜜、宁夏棉花蜜、吉林椴树蜜、陕西枣花蜜、山东洋槐蜜、内蒙古荞麦蜜、新西兰麦努卡蜂蜜、西班牙桉树蜜和澳大利亚麦努卡蜂蜜等11种蜂蜜样品进行3个不同加标水平的回收率测定,每个水平平行测定5次,加标回收率及相对标准偏差结果见表2。
对8个国产蜂蜜及3个进口蜂蜜样品进行了筛查。结果发现,野百合碱、克氏千里光宁和倒千里光碱均未检出;而千里光菲啉和千里光宁在大多数蜂蜜中均能检出,千里光菲啉含量在11.0～31.1 μ g/kg 范围内,千里光宁含量在8.3～29.1 μ g/kg 范围内。阳性蜂蜜样品的选择离子流色谱图见图2。
本文建立了蜂蜜中野百合碱、克氏千里光宁、倒千里光碱、千里光菲啉、千里光宁共5种双稠吡咯啶类生物碱的高效液相色谱-串联三重四极杆质谱分析方法。该方法前处理过程简便、灵敏度高,为蜂蜜中双稠吡咯啶类生物碱含量的监控提供了技术保障。由于双稠吡咯啶类生物碱种类繁多,在饲料、牛羊内脏及其乳制品中都易出现残留,但有很多种类受到标准品的限制还没有建立相应的检测方法,有必要进一步深入和拓展现有的研究。
2013, Vol. 31 Issue (11): 1046-1050
PDF (772KB)
2013, Vol. 31 Issue (11): 1046-1050
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