ZNCL-S型智能恒温磁力搅拌器(河南爱博特科技发展有限公司), DZF-6020型真空干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司), AS20500AT超声波清洗机(天津奥特赛恩斯仪器有限公司), AE-100电子天平(Mettler Toledo公司), Vario EL III元素分析仪(Elementar公司)。高效液相色谱系统由P230高压恒流泵、UV230⁺紫外-可见检测器、Rheodyne 7725i手动进样阀、EC2000色谱工作站组成(大连依利特分析仪器有限公司)。

用作参比的反相色谱柱为大连依利特分析仪器有限公司的C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μ m)。

硅胶(5 μ m，290 m²/g)， γ -氨丙基三乙氧基硅烷(阿法埃莎化学有限公司)，盐酸、四氢呋喃、苯胺、二氯甲烷(天津科密欧试剂有限公司)，甲苯、三乙胺(上海国药试剂有限公司)，N,N-二异丙基乙二胺、苯胺、对硝基苯胺、2,2′-联吡啶、4,4′-联吡啶、邻硝基苯胺、甲萘胺、2,6-二甲基吡啶、对氨基苯甲酸(百灵威科技有限公司)，所有试剂均为分析纯；甲醇、乙腈(Tedia公司)，二者均为色谱纯；4A分子筛，Milli-Q超纯水(18.2 M Ω ·cm)。

反应共分为4步:(1)经过酸化处理的硅胶与 γ -氨丙基三乙氧基硅烷反应(溶剂为甲苯),得到中间产物1; (2)中间产物1与三聚氯氰在0～5 ℃条件下反应(溶剂为四氢呋喃),得到中间产物2; (3)中间产物2与乙二胺反应(溶剂为甲苯),得到中间产物3; (4)中间产物3与十二酰氯反应(溶剂为四氢呋喃),得到三嗪环酰胺键合固定相。其中第2步和第4步反应均以N,N-二异丙基乙二胺作为缚酸剂。每步反应结束后依次用对应溶剂、甲醇、二氯甲烷洗涤数次,真空干燥。

采用元素分析法对制得的中间产物及固定相进行表征,通过测定其中C、N、H元素的含量,计算固定相表面配体的覆盖率。

选取合适的匀浆和加压溶剂,在一定压力下以匀浆法将所制得的固定相装入150 mm×4.6 mm的不锈钢色谱柱管中。

分离5种苯胺类化合物的流动相:甲醇/水(60/40, v/v);分离4种吡啶类化合物的流动相:乙腈/水(50/50, v/v);流速:1.0 mL/min;检测波长:254 nm;柱温:30 ℃。

对于碱性化合物的分离,含有多氮基团的配体是大多数研究者的理想选择之一。常见的多氮基团配体一般来源于复杂的合成和纯化,成本较高,难于推广。

三聚氯氰是一种常用的活性染料和农药中间体,其分子呈对称性结构,存在较大的平面共轭 π 电子体系,具备作为反相色谱配体的理想结构。另外,三聚氯氰分子内的3个氯原子可以与氨基、羟基等反应,尤其在与氨基反应时随着反应温度的不同可以实现不同氯原子的取代反应,得到明确的反应产物;再与酰氯进行后续反应,得到含有酰胺基团的固定相。

设计三嗪环酰胺极性固定相,理论上可能存在以下可以改善碱性化合物分离的机理^{[ 13 ]}:1)空间位阻效应(如图1a),由于三嗪环分子相对较大,空间位阻较大,可以屏蔽硅胶表面残余的硅羟基,从而使其无法与碱性化合物发生作用;2)竞争氢键作用和静电屏蔽作用(如图1b和图1c),含有酰胺基团的固定相,其酰胺基团能与溶质之间形成氢键和静电屏蔽作用,在分离碱性化合物时进一步阻止残余硅羟基的作用。

图 1 新型三嗪环酰胺固定相分离碱性物质的机理示意图 Fig. 1 Structural diagrams showing possible mechanisms for the separation of basic compounds on S&A SP a. the steric effect; b. the analyte competes with polar group for a silanol; c. the effect of electrostatic shield.

由于键合相中含有乙氧基,在键合或后处理过程中可能导致其不确定的流失,因此为确保键合量的准确性,采用氮元素的含量^{[ 14 ]}来计算每一步反应的键合量:键合量=(C₁-C₀)/(M×N×S)×10⁴,其中C₁为相应产物的氮含量,C₀为硅胶基质的氮含量,M为氮原子的摩尔质量,N为氮原子的个数,S为硅胶基质的比表面积。

表1为新型三嗪环酰胺固定相合成过程中各步反应产物的元素分析结果,最终产物4的碳含量为18.97% 。根据氮元素的含量可以计算出该固定相的键合量为1.83 μ mol/m²。重复3次实验得到固定相的C、N、H含量的最大相对偏差分别为3.04% 、4.13% 、3.55% ,均小于5% ,表明该方法制备固定相的重现性良好。

表 1 新型三嗪环酰胺固定相制备过程中各步产物的元素分析结果 Table 1 Elemental analysis results of the products in the preparation of S&A SP Product w(C)/% w(N)/% w(H)/% 1 6.42 1.73 1.99 2 7.83 4.02 1.83 3 9.59 5.38 2.23 4 18.97 5.41 3.68

表 1 新型三嗪环酰胺固定相制备过程中各步产物的元素分析结果 Table 1 Elemental analysis results of the products in the preparation of S&A SP

选取了5种苯胺类化合物(苯胺、对硝基苯胺、邻硝基苯胺、甲萘胺、对氨基苯甲酸),在1.3节的色谱条件下,考察其在新型固定相装填的色谱柱上与商品化C18色谱柱上的保留行为,色谱分离情况如图2a和图2b所示。

图 2 (a)新型三嗪环酰胺固定相色谱柱和(b)商品化C18柱分离苯胺类碱性化合物的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of anilines on (a) the S&A SP column and (b) a commercial C18 column Peaks: 1. aniline; 2. p-nitroaniline; 3. o-nitroaniline; 4. methyl naphthylamine; 5. p-amino benzoic acid.

在新型三嗪环酰胺固定相色谱柱中,苯胺、对硝基苯胺、邻硝基苯胺和甲萘胺这4种物质的洗脱顺序与其疏水性强弱顺序一致,主要基于疏水作用原理分离。在商品化的C18柱上,苯胺和对硝基苯胺的色谱峰完全重叠。而在新型三嗪环酰胺固定相色谱柱上,由于对硝基苯胺中- NO₂具有吸电子效应,降低了苯环体系的电子云密度,使对硝基苯胺成为电子接受体,与固定相之间容易产生 π - π 电荷转移,增强了对硝基苯胺在固定相上的保留,使对硝基苯胺的保留比苯胺强,因此这2种物质实现了良好的分离,分离度达6.63。对氨基苯甲酸在两种固定相上的出峰顺序不一致,这是由于其结构中同时含有氨基和羧基,可与内嵌三嗪环上的酰胺基团形成强烈的氢键作用,具有最强的保留,因此在三嗪环酰胺固定相上最晚出峰。

表2为这5种物质在2种色谱柱上分离时的拖尾因子,表明在新型三嗪环酰胺固定相上,除对氨基苯甲酸外,其余4种碱性苯胺类物质的对称性良好,拖尾因子在0.95～1.13之间;而在商品化C18色谱柱上,上述5种物质的拖尾因子均较高,均大于2。这说明新型三嗪环酰胺固定相在分离碱性化合物时,较好地解决了色谱峰拖尾的问题。

表 2 S&A SP柱和商品化C18柱分离5种苯胺类 化合物时色谱峰的拖尾因子 Table 2 Tailing factors (Tf) of peaks of the five anilines on the S&A SP column and a commercial C18 column Aniline Tf(S&A SP column) Tf(Commercial C18 column) Aniline 1.08 -* p-Nitroaniline 1.10 - o-Nitroaniline 1.13 2.12 Methyl naphthylamine 0.95 2.05 p-Amino benzoic acid 2.13 2.31 * On the commercial C18 column, aniline and p-nitroaniline didn’t have tailing factors because their peaks overlapped.

表 2 S&A SP柱和商品化C18柱分离5种苯胺类 化合物时色谱峰的拖尾因子 Table 2 Tailing factors (Tf) of peaks of the five anilines on the S&A SP column and a commercial C18 column

为了进一步考察新型三嗪环酰胺固定相对碱性物质的分离情况,在1.3节的色谱条件下,考察了4种吡啶类化合物(吡啶、2,6-二甲基吡啶、2,2′-联吡啶、4,4′-联吡啶)在三嗪环酰胺固定相色谱柱与商品化C18色谱柱上的保留行为,色谱分离情况分别如图3a和图3b所示。

图 3 (a)新型三嗪环酰胺固定相色谱柱和(b)商品化C18柱分离吡啶类碱性化合物的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of pyridines on (a) the S&A SP column and (b) a commercial C18 column Peaks: 1. 2,6-lutidine; 2. pyridine; 3. 4,4′-dipyridine; 4. 2,2′-dipyridine.

在商品化C18柱上,2,6-二甲基吡啶和2,2′-联吡啶由于含有疏水性基团,疏水性增强,所以保留作用比吡啶强。按照疏水性原理,这4种化合物的出峰顺序应为4,4′-联吡啶、吡啶、2,6-二甲基吡啶、2,2′-联吡啶。

4种物质在新型三嗪环酰胺固定相装填的色谱柱上的洗脱顺序与在商品化C18色谱柱上不一致,说明分离时疏水作用不是其唯一的作用机理。由于4,4′-联吡啶和2,2′-联吡啶含有2个大环结构,其分子平面的大 π 电子体系易与固定相之间发生 π - π 电子作用,故保留时间比吡啶长。吡啶环中包含1个氮原子,能与固定相配体分子之间形成氢键,氢键的作用使疏水性相对较弱的吡啶在疏水性相对较强的2,6-二甲基吡啶之后出峰。

对比图3a和图3b可以看出,4种吡啶类碱性化合物,尤其是2,6-二甲基吡啶和2,2′-联吡啶在新型三嗪环酰胺固定相上能实现较好的分离,进一步体现了自制的新型三嗪环酰胺固定相在碱性化合物分离中的优越性。