色谱  2013, Vol. 31 Issue (12): 1189-1193   PDF (876KB)    
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王红瑞
谢媛媛
梁琼麟
王义明
胡坪
罗国安
高效液相色谱-串联质谱法同时测定烟草中5种Amadori化合物
王红瑞1,2, 谢媛媛2 , 梁琼麟2, 王义明2, 胡坪1, 罗国安1,2     
1. 华东理工大学药学院, 上海 200237;
2. 清华大学化学系, 北京 100084
收稿日期：2013-6-14
基金项目：中国烟草总公司特色优质烟叶开发重大专项（TS-05-20110034）
通讯作者：罗国安,Tel:(010)62781688,E-mail:luoga@mail.tsinghua.edu.cn;谢媛媛,Tel:(010)62794103,E-mail:yuanyuan8078@gmail.com.
摘要：建立了高效液相色谱-三重四极杆质谱（HPLC-QqQ MS）联用定量分析烟草中5种Amadori前香物质的方法。样品经含5%（v/v）甲醇的水提取后，采用Waters XBridgeTM Amide色谱柱（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）、以甲醇-水为流动相进行分离，采用多反应监测（MRM）模式测定烟草样品中5种Amadori化合物的含量。结果表明，5种Amadori化合物的峰面积与质量浓度的线性关系良好，相关系数r为0.9895~0.9989；定量限（S/N=10）在10.18~44.58 μg/L，检出限（S/N=3）在3.51~14.86 μg/L；平均加标回收率为92.6%~123.6%，相对标准偏差（RSD）小于9.4%。本方法操作简便、灵敏度高、分析速度快，可以用于烟叶及卷烟中5种主要Amadori类物质的含量测定。
关键词： 高效液相色谱-串联质谱     Maillard反应     Amadori化合物     前香物     烟草    
Simultaneous determination of five Amadori compounds in tobacco by high performance liquid chromatography-mass spectrometry
WANG Hongrui1,2, XIE Yuanyuan2 , LIANG Qionglin2, WANG Yiming2, HU Ping1, LUO Guoan1,2     
1. School of Pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China;
2. Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084, China
Received: 2013-6-14
Abstract: A method of high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (HPLC-QqQ MS) in multiple reaction monitoring (MRM) mode for simultaneous determination of five Amadori compounds in tobacco has been developed. The separation was performed on an XBridgeTM Amide column (250 mm×4.6 mm, 3.5 μm) by gradient elution using methanol and water as mobile phases. The linearity of this method was good with the correlation coefficients (r) of 0.9895-0.9989. The limits of detection (S/N=3) were from 3.51 μg/L to 14.86 μg/L, and the limits of quantitation (S/N=10) were from 10.18 μg/L to 44.58 μg/L. The recoveries varied from 92.6% to 123.6% with the relative standard deviations (RSDs) less than 9.4%. The established method is rapid, accurate, robust and convenient, and it could be applied to the measurement of the five Amadori compounds in tobacco and cigarettes.
Key words: high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)     Maillard reaction     Amadori compounds     precursor aroma     tobacco    

Amadori化合物是还原糖(以葡萄糖为代表)和氨基化合物(以氨基酸为主)发生Maillard(非酶促棕色化)反应生成的一类关键中间产物 1-氨基-1-脱氧-2-酮糖,是N-取代葡萄糖经Amadori重排而来[ 1 ]。Amadori重排产物在不同温度和pH值条件下能进一步发生一系列复杂的反应,生成多种具有芳香气味的小分子化合物和具有棕黑颜色的高分子化合物 类黑素,从而影响食品或烟草的香味和颜色。Amadori是卷烟中非常重要的一类前香物质,其种类和含量与烟草的香型和质量关系密切[ 2 ]。因此,定性定量分析烟草中的Amadori化合物对提高卷烟质量具有一定意义。

1-氨基-1-脱氧酮糖类化合物极性强、种类多,定性定量分析烟草中这类化合物的难度较大,目前的分析方法主要有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(包括二极管阵列检测(DAD)和蒸发光散射检测(ELSD))和离子交换色谱法等[ 3, 4, 5, 6 ]。其中,GC方法需要将Amadori化合物衍生为可气化的成分,衍生化过程复杂,对结果的准确性具有一定影响[ 3 ];由于Amadori化合物几乎无紫外吸收,因此采用HPLC-DAD进行分析时,需要柱后衍生显色,分离效果不佳[ 3 ];另外,由于烟草基质复杂,Amadori化合物的含量较低,而ELSD的检测灵敏度较低,故HPLC-ELSD不适于Amadori化合物的分析[ 6 ]; Davidek等[ 5 ]采用阳离子交换色谱-质谱联用技术分析果干中的Amadori化合物,得到了较好的效果,但该方法受样品中糖的干扰较大,还需要特殊的离子树脂分析柱,且色谱峰拖尾严重。高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术是20世纪90年代成熟起来的一项新技术,具有灵敏度高、选择性强的特点,不仅能够对复杂混合体系进行色谱分离,而且还能通过质谱的质量选择对分离效果不好的化合物进行分离,通过多级串联质谱技术还可以提供被分析成分的结构信息[ 7 ]。

烟草中Amadori化合物的种类及含量差异很大,有些化合物(如1-脱氧-1-L-亮氨酸-D-果糖,Fru-Leu)因存在同分异构体而不易得到分离分析;有些化合物(如1-脱氧-1-L-天冬酰胺-D-果糖,Fru-Asn)因易发生变质而不稳定。本文选择5种易分析且较稳定的Amadori化合物作为研究对象,在前期掌握的准确相对分子质量及基于多级质谱明确的Amadori化合物质谱裂解规律研究的基础上,建立了高效液相色谱-串联三重四极杆质谱(HPLC-QqQ MS)联用方法分析检测烟草中5种Amadori前香物质。



1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱仪-6460串联三重四极杆质谱仪(包括高压二元梯度泵、在线脱气单元、自动进样器、柱温箱、电喷雾离子源)(美国Agilent公司); Millipore超纯水仪(美国Millipore公司); SL300N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司); XS105型电子天平(d=0.01 mg,瑞士梅特勒-托利多公司); KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); MIKRO 22R台式离心机(德国Hettich公司)。

1-脱氧-1-L-丙氨酸-D-果糖(Fru-Ala,批号:3-XDD-21-3,纯度:96% )、1-脱氧-1-L-缬氨酸-D-果糖(Fru-Val,批号:12-ELZ-106-5,纯度:98% )、1-脱氧-1-L-脯氨酸-D-果糖(Fru-Pro,批号:4-ZCA-117-2,纯度:98% )、1-脱氧-1-L-苯丙氨酸-D-果糖(Fru-Phe,批号:4-ZCA-111-4,纯度:97% )和1-脱氧-1-L-色氨酸-D-果糖(Fru-Trp,批号:13-XDZ-40-1,纯度:98% )标准品均购自加拿大TRC公司。甲醇为色谱纯(美国J. T. Baker公司),实验用水为Milli-Q超纯水,其他有机试剂均为分析纯。本研究所用烟草样品分别产自福建、云南、黑龙江、河南和山东等地,由上海烟草集团有限责任公司技术中心提供。

1.2 标准储备液和工作溶液的配制

分别精确称取10 mg的Fru-Ala、Fru-Val、Fru-Pro、Fru-Phe和Fru-Trp标准品,用含5%(v/v)甲醇的水溶解并定容至10 mL,配制成质量浓度为1 g/L 的标准储备液,置于4 ℃冰箱中避光保存。临用时,将上述标准储备液用含5%(v/v)甲醇的水稀释配成质量浓度均为 2000 μ g/L 的含5种Amadori化合物的混合标准溶液,并根据需要稀释成不同浓度的标准工作液。

1.3 色谱条件

色谱柱:XBridgeTM Amide(250 mm×4.6 mm, 3.5 μ m);流速:0.4 mL/min;进样量:10 μ L;柱温:30 ℃;流动相为甲醇(A相)和水(B相),梯度洗脱程序为:0～10 min, 5%A, 10～20 min, 5%A～30%A。

1.4 质谱条件

离子源:电喷雾离子源(ESI);离子化方式:正离子;扫描方式:多反应监测(MRM);毛细管电压:4.0 kV;离子源温度:150 ℃;干燥气温度:350 ℃;干燥气流速:8 L/min;碰撞气:高纯氮气(99.999% );碰撞气压力：0.40 MPa;雾化气温度:45 ℃。

1.5 样品处理

准确称取25 mg干燥后的烟草粉末于100 mL具塞试管中,用95 mL水浸泡30 min后,在10 ℃水浴中超声提取15 min,用定性滤纸减压过滤,将滤液转移到100 mL容量瓶中,加适量甲醇定容,摇匀,静置10 min后,取1 mL上清液于1.5 mL离心管中,于 10000 r/min 离心20 min,取0.5 mL作为供试品溶液。

2 结果与讨论
2.1 色谱与质谱条件的建立

Amadori化合物呈酸性。本研究选用具有酰胺键合固定相的XBridgeTM Amide色谱柱,该色谱柱填料的酰胺(氨基甲酰)官能团同时具有氢原子受体和供体位点,有利于酸性分析物的保留。以甲醇和水为流动相,5种目标成分的峰形良好、检测灵敏度较高。图1为5种Amadori化合物混合标准溶液的总离子流图。

分别以正、负离子模式及不同的裂解电压进行 扫描,发现在正离子(ESI+)模式下灵敏度较高,且能得到丰度较高的准分子离子峰和子离子峰,故选择正离子电离模式。分别对质量浓度为 1000 μ g/L 的5种Amadori化合物标准溶液进行一级质谱扫描,确定各个化合物的准分子离子峰,并分别优化其裂解电压,然后分别以其准分子离子为母离子,通过高纯氮气碰撞对产生的碎片离子进行二级质谱扫描,同时优化碰撞能量。选择丰度较高的碎片离子[M+H-2H2O]+、[M+H-2H2O-CO]+或[M+H-C5H10O5]+(M代表Amadori化合物)作为定性和定量的特征离子。图2为Amadori化合物的质谱碎裂形式。通过优化,5种Amadori化合物的定性与定量特征离子及优化后的质谱参数见表1。

图 1 5种Amadori化合物混合标准溶液的总离子流图 Fig. 1 TIC chromatogram of the five Amadori standards a. Fru-Ala; b. Fru-Val; c. Fru-Pro; d. Fru-Phe; e. Fru-Trp.

图 2 Amadori化合物的质谱裂解方式 Fig. 2 Mass spectrometry fragmentation patterns of an Amadori compound AA: amino acid.

表 1 5种Amadori化合物的液相色谱保留时间和质谱参数 Table 1 HPLC retention times and MS/MS parameters for the five Amadori compounds
2.2 方法的线性范围、检出限和精密度

将质量浓度均为 2000 μ g/L 的5种Amadori化合物的混合标准溶液稀释,配制成系列标准溶液(1000、750、500、300、100、50、10 μ g/L),进样10 μ L进行分析。分别以各化合物质量浓度( μ g/L)为横坐标x、峰面积为纵坐标y绘制标准曲线,各成分的回归方程、相关系数r及线性范围见表2。将5种Amadori化合物混合对照品溶液分别稀释不同倍数后,按信噪比(S/N)为3及10测定5个成分的检出限(LOD)及定量限(LOQ),结果见表2。精密吸取100 μ g/L 混合对照品溶液10 μ L,连续进样测定6次,计算5种Amadori化合物峰面积的RSD在2.1% ～4.7%之间,表明仪器稳定性良好。

表 2 5种Amadori化合物的线性关系、相关系数(r)、检出限及定量限 Table 2 Linear relationships, correlation coefficients (r), limits of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ) of the five Amadori compounds

5种Amadori化合物标准溶液的MRM提取离子流图见图3。

图 3 基于LC-MS/MS的标准溶液和烟草样品中5种Amadori化合物的MRM谱图 Fig. 3 MRM chromatograms of the five Amadori compounds in standard solution and a tobacco sample by LC-MS/MS a. Fru-Ala; b. Fru-Val; c. Fru-Pro; d. Fru-Phe; e. Fru-Trp.
2.3 方法的回收率和精密度

精密称取5种Amadori化合物含量已知的烟草样品,分别精密加入高、中、低3个水平的标准品,每个水平平行3份,按1.5节方法制备供试溶液并进行分析。结果显示:Fru-Ala、Fru-Val、Fru-Pro、Fru-Phe和Fru-Trp的平均加标回收率为92.6% ～123.6% , RSD为0.8% ～9.4%(见表3),表明该方法回收率良好。

表 3 5种Amadori化合物在烟草样品中 的加标回收率(n=3) Table 3 Recoveries of the five Amadori compounds in tobacco samples (n=3)
2.4 供试品溶液的稳定性

精密吸取室温下的同一供试品溶液,分别放置0、4、8、12和24 h后进行分析,结果样品中5种Amadori化合物峰面积的RSD在1.9%和4.0%之间,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5 样品含量测定

取来源于不同产地的不同香型烟草样品,按1.5节制备不同批号样品的供试品溶液各3份,按照所建立的方法对烟草中5种Amadori化合物进行测定,并计算含量,结果见表4和图3。

表 4 不同烟草样品中5种Amadori化合物的含量 Table 4 Contents of the five Amadori compounds in different tobacco samples
3 结论

本研究在前期掌握的准确相对分子质量及基于多级质谱明确的Amadori化合物质谱裂解规律研究的基础上,建立了高效液相色谱-串联三重四极杆质谱联用技术同时测定烟草中5种Amadori前香物质含量的分析方法。通过对色谱柱填料、流动相种类等条件的优化,最后确定了HPLC-MS/MS测定方法。该方法样品前处理简单,且具有快速简便,灵敏度高、专属性强等特点,方法学指标较好,适合于烟草样品中Amadori化合物的分析检测。

参考文献
[1]Cui T, Mao D B, Xu Z J. Guangxi Journal of Light Industry (崔韬, 毛多斌, 许志杰. 广西轻工业), 2010(12): 29
[2]Wang J, Lu Y M, Liu B Z, et al. J Mass Spectrom, 2008, 43: 262  
[3]Eichner K, Reutter M, Wittmann R. The Maillard Reaction in Food ProcessIng, Human Nutrition and Physiology. Basel, Switzerland: Birkhauser Verlag, 1990: 63
[4]Davidek T, Clety N, Devaud S, et al. J Agric Food Chem, 2003, 51: 7259  
[5]Davidek T, Kraehenbuehl K, Devaud S, et al. Anal Chem, 2005, 77: 140  
[6]Yang J Y, Mou D R, Mei Y, et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory (杨金英, 牟定荣, 梅勇, 等. 分析试验室), 2010, 29(8): 97
[7]Li W W, Dai Y H, Wu M J, et al. Journal of Instrumental Analysis (李苇苇, 戴云辉, 吴名剑, 等. 分析测试学报), 2009, 28(12): 1428