Agilent 7890型气相色谱仪,配备5975C质谱检测器(美国Agilent公司)。Dionex ASE 300型加速溶剂萃取仪(美国Dionex公司)。TurboVap 500型浓缩仪(美国Zymark公司)。

8个毒杀芬同类物标准样品购自美国RT Corp公司。工业毒杀芬标准样品购自美国Restek公司。PCB混合标准液(包括42个单体)和单标准溶液(PCB204和PCB209),以及4,4′-二溴八氟联苯(DBOFB)购自美国Accustandard公司。正己烷(农残级)、二氯甲烷(HR-GC级)、硅胶(60～200目)购自美国J. T. Baker公司。氧化铝(60～325目)购自美国Fisher Scientific公司。硅胶和氧化铝分别于160 ℃和250 ℃下活化12 h,然后加入3%(质量分数)的去离子水去活,保存在正己烷中备用。无水硫酸钠(美国Mallinckrodt公司)于500 ℃下烘焙4 h备用。凝胶渗透色谱(GPC)填料SX-3 Bio-Beads(美国Bio-Rad公司)。

沉积物采自美国加州蒂华纳河口(Tijuana River estuary)。三文鱼样品购自美国加州某超市。所有样品均于-20 ℃下保存。

冷冻干燥后的沉积物(1～5 g干重)和三文鱼样品(2.5～5 g干重)分别装入加速溶剂萃取仪的34 mL不锈钢萃取池中,加入回收率指示物DBOFB和PCB209(每个25 ng,以使在定容后的样品萃取液中的目标质量浓度为50 μ g/L)后,以二氯甲烷为溶剂,进行加速溶剂萃取(ASE)。萃取条件:100 ℃和10.3 MPa下静态萃取5 min,进行4次提取循环,然后用60%的萃取池体积的二氯甲烷冲洗萃取池,最后用高纯氮气吹扫萃取池100 s。所收集的提取液在旋转蒸发仪上浓缩至约3 mL,加入约5 mL正己烷,再浓缩,以置换提取液中的二氯甲烷,这样置换3次,得到以正己烷为溶剂的萃取液。对于沉积物的萃取液,加入活化铜粉去硫,室温下避光放置过夜。取3 μ L×3三文鱼萃取液在微量天平上测定样品的脂肪含量,其余萃取液须经GPC净化。GPC玻璃柱(2.5 cm(内径)×50 cm(长))装填40 g SX-3 Bio-Beads。上样后,用二氯甲烷-正己烷(体积比为1 ∶ 1)混合液洗脱,收集第100至220 mL的洗脱液。该洗脱液用上述方法在旋转蒸发仪上浓缩、溶剂置换为正己烷,待进一步净化。

经脱硫的沉积物萃取液和经GPC净化的三文鱼萃取液进一步由硅胶和氧化铝复合玻璃柱(10 mm(内径)×30 cm(长))净化。该柱由下到上依次装填约1 cm的无水硫酸钠、12 cm的硅胶(约4.7 g)、6 cm的氧化铝(约5.7 g)和约1 cm的无水硫酸钠。上样后,先用15 mL正己烷洗脱,并全部收集之;然后使用60 mL二氯甲烷-正己烷(3 ∶ 7,体积比)混合液洗脱并收集。收集的洗脱液用上述方法在旋转蒸发仪上浓缩、溶剂置换为正己烷后,定容至0.5 mL,加入内标PCB204(50 μ g/L),待GC/NCI-MS测定^{[ 33, 34 ]}。

色谱柱为DB-XLB (30 m×0.25 mm×0.25 μ m);载气为氦气(纯度≥99.999% ),流量为1 mL/min;进样口温度280 ℃,不分流进样,进样量1 μ L;升温程序:90 ℃保持1 min,以5 ℃/min 速率升至150 ℃,以3 ℃/min 速率升至260 ℃,再以20 ℃/min 速率升至320 ℃,保持5 min。样品的分析时间是57 min。

质谱检测器用负化学电离源。反应气为甲烷(纯度≥99.99% ), 40%流量。电离源和四极杆温度150 ℃;传输线温度280 ℃;选择离子检测(SIM)模式;溶剂延迟8 min。

使用DB-XLB色谱柱可以很好地分离8个毒杀芬同类物(见图1)。表1列出了以PCB204为内标的8个毒杀芬同类物的相对保留时间(RRT),即目标化合物的保留时间与内标PCB204的保留时间的比值。进样这8个毒杀芬同类物和PCB的混合标准液发现,有几个毒杀芬同类物会与PCB单体共流出,例如,P26与PCB81, P40与PCB158, P41部分地与PCB138, P44部分地与PCB187共流出。这些共流出的色谱峰若以ECD检测,则无法分辨。然而,在NCI-MS的SIM模式下,除了PCB187有可能会因氧反应而干扰P44的定量外,其他共流出的PCB单体不会对相应的毒杀芬同类物产生影响。此外,P44还会受另一个保留时间相近的毒杀芬同类物P42拖尾的影响,因此,在识别和积分P44色谱峰时要特别注意。另一方面,这也就使得色谱峰保留时间的稳定性在分析毒杀芬同类物时显得更加重要。在本研究的色谱条件下,连续多次进样的相对保留时间的相对标准偏差(RSD)小于0.02% ,显示了色谱峰保留时间的高稳定性。

图1

Fig. 1

图 1 8个毒杀芬同类物校正标准溶液(200 μ g/L)在选择离子检测模式下的GC/NCI-MS色谱图 Fig. 1 GC/NCI-MS chromatogram of the eight toxaphene congeners in calibration standard (200 μ g/L) under the selected ion monitoring mode Peaks: 1. Hx-Sed; 2. Hp-Sed; 3. P26; 4. P41; 5. P40; 6. P44; 7. P50; 8. PCB204; 9. P62; 10. PCB209.

表 1 以PCB204为内标的8个毒杀芬同类物的相对保留时间 (RRT)和平均相对响应因子(RRF )及相对响应因子(RRF)的相对标准偏差(RSD) Table 1 Relative retention times (RRTs), average relative response factors (RRF s), and relative standard deviations (RSDs) of the relative response factors (RRFs) of the eight toxaphene congeners with PCB204 as internal standard Congener RRT RRF RSD of RRF/% Hx-Sed 0.79 0.406 7.6 Hp-Sed 0.81 0.296 8.2 P26 0.82 0.084 5.3 P41 0.93 0.350 6.2 P40 0.94 0.253 5.1 P44 0.94 0.113 10.6 P50 0.96 0.137 8.3 P62 1.06 0.007 18.2

表 1 以PCB204为内标的8个毒杀芬同类物的相对保留时间 (RRT)和平均相对响应因子(RRF )及相对响应因子(RRF)的相对标准偏差(RSD) Table 1 Relative retention times (RRTs), average relative response factors (RRF s), and relative standard deviations (RSDs) of the relative response factors (RRFs) of the eight toxaphene congeners with PCB204 as internal standard

毒杀芬在较低的离子源温度下产生较高的离子丰度^{[ 32, 35 ]}。例如,在本研究中,150 ℃的离子源产生的离子丰度是106 ℃的(79±4.8)% 。但是106 ℃的离子源温度易受到从色谱柱来的高温载气的影响而产生波动,因此离子源的温度还是选择在150 ℃。

毒杀芬总量和8个毒杀芬同类物的GC/NCI-MS分析采用同一套质谱参数。在SIM模式下的定性、定量分析离子见表2。毒杀芬在GC/NCI-MS的选择离子扫描模式下的总离子流图见图2。

表 2 GC/NCI-MS分析毒杀芬的定性和定量离子 Table 2 Quantitation and confirmation ions for toxaphene analysis by GC/NCI-MS Category Compounds Quantitation ion (m/z) Confirmation ions (m/z) 6-Cl Hx-Sed 309 307, 311 7-Cl Hp-Sed 343 341, 345 8-Cl P26, P40, P41 379 377, 381 9-Cl P50, P62 413 411, 415 10-Cl 10-Cl congener 447 445, 449 Surrogate DBOFB 456 Surrogate PCB209 498 Internal standard PCB204 430 Product of oxygen reaction 411

表 2 GC/NCI-MS分析毒杀芬的定性和定量离子 Table 2 Quantitation and confirmation ions for toxaphene analysis by GC/NCI-MS

图2

Fig. 2

图 2 工业毒杀芬校正标准溶液(250 μ g/L)在选择离子检测模式下的GC/NCI-MS色谱图 Fig. 2 GC/NCI-MS chromatogram of the technical toxaphene calibration standard (250 μ g/L) under the selected ion monitoring mode

8个毒杀芬同类物的定量采用单个离子的峰面积。毒杀芬同类物的系列校正标准溶液的质量浓度分别为0.5、5、25、100、200、300和500 μ g/L。以PCB204为内标,内标法的校正曲线的线性相关系数均大于0.99。这里,毒杀芬同类物和总毒杀芬的定量都使用平均相对响应因子(RRF )。RRF 为一系列校正标准溶液中相对响应因子(RRF)的平均值。只有这些RRF的RSD小于20%才能得到一个合格的RRF ,使用RRF 定量才可以得到准确的结果。从表1可以看出,所有RRF的RSD均小于20% 。此外,8个毒杀芬同类物的RRF 有很大的差别,其中P62的RRF 比其他同类物的RRF 小1到2个数量级。这反映了毒杀芬同类物由负化学电离源产生响应的差别,也是用GC/NCI-MS分析毒杀芬的不足之处。

对于最低的质量浓度0.5 μ g/L, 8个毒杀芬同类物中只有P62不能被检测到。因而,P62的相对响应因子从5 μ g/L 开始计算。

把从这些标准溶液得到的RRF 分别代回(re-fitting)各级标准溶液的内标校正公式(1):

毒杀芬总量的定量采用可检测到的毒杀芬同类物峰面积的和。具体地说是加合六氯到十氯同类物,即离子m/z 309、343、379、413和447的峰面积,积分的时间窗口以Hx-Sed为起始至PCB209出峰前(本研究为28～51 min,见图3)。在积分时间窗口内,要对每一个选择离子色谱图中的每一个信噪比大于3 (S/N≥3)的色谱峰进行识别,积分出毒杀芬同类物的峰面积,然后加合起来。显然,这是一项相当费时的过程。过去,人们简单地积分色谱基线以上所有峰的面积(area under the curve)来快速得出总面积^{[ 9 ]}。由于有干扰物的共流出,这一方法产生正偏差的几率较大。GC/NCI-MS的选择离子扫描模式可以有效地避免这一状况的发生。

图3

Fig. 3

图 3 工业毒杀芬校正标准溶液(250 μ g/L)在选择离子检测模式下的GC/NCI-MS谱图 Fig. 3 GC/NCI-MS chromatograms of the technical toxaphene calibration standard (250 μ g/L) under the selected ion monitoring mode

对总毒杀芬的定量试验测试了质量浓度为25、50、100、150、200、250和500 μ g/L 的系列校正标准溶液。以PCB204为内标,除25 μ g/L 外,RRF 代回各级标准溶液得到的RE在±30%之内,因此确定总毒杀芬的LLOQ为50 μ g/L,并且以此浓度为系列校正标准溶液的最低浓度。

由于存在PCB氧反应的缘故,毒杀芬的分析必须要同步检测GC/NCI-MS仪器系统的氧反应水平。PCB氧反应水平(OR)通常用PCB204来测量,由式(3)求出:

图4

Fig. 4

图 4 PCB204氧反应产生的干扰和P50在选择离子检测 模式下的GC/NCI-MS质谱图 Fig. 4 GC/NCI-MS selected ion monitoring mass spectra of PCB204 interference due to oxygen reaction and P50

一个正常运转且干净的NCI-MS离子源起初可以达到0.2%的氧反应水平,但其会随着分析样品数量的增加而增加。PCB氧反应水平应尽量控制在小于0.5% ,不能大于1% 。在分析毒杀芬期间,每天吹扫一次离子源可以有效地降低氧反应水平。理论上可以有127个五氯到九氯的PCB单体会由于氧反应而产生干扰,特别是12个PCB八氯单体(PCBs 194～205)会对八氯和九氯的毒杀芬同类物产生干扰。如果样品中PCB的含量很高,即使有低的氧反应水平也会产生大的干扰,因此更要仔细进行色谱峰的逐一识别。具体方法详见文献^{[ 22 ]}。

沉积物和鱼样在ASE上由二氯甲烷萃取,经样品净化,替代物DBOFB的回收率在60% ～130% , PCB209的回收率在70% ～130% 。萃取并测定了毒杀芬同类物加标(80 ng/g干重)的沉积物样品,日间重复样的RSD范围是5.4% ～12.8% (n=10)。日间测定的同类物平均回收率是(90.8±17.4)% (n=10),说明本方法的准确性和精确性都很高。对于鱼肉样品,笔者已经报道了用美国标准局的鱼标准样品SM1946进行的确证^{[ 22 ]}。谢原利等^{[ 26 ]}考察了温度和压力对ASE萃取土壤样品的影响,在温度为70～130 ℃范围内和8.26～13.78 MPa下,毒杀芬的回收率达90% ～110% 。本方法所用的ASE萃取条件为100 ℃和10.3 MPa,也恰好在上述温度和压力的范围内。

美国加州蒂华纳河口沉积物中毒杀芬含量见表3,其中,TJR6012的数值是2个平行样的平均值和标准偏差。以5 g沉积物干重为基准,P62的LLOQ是0.5 ng/g,其他7个毒杀芬同类物的LLOQ是0.05 ng/g。总毒杀芬的LLOQ是5 ng/g。所有8个毒杀芬同类物都被检出,但含量很低,只有个别样品的Hx-Sed, Hp-Sed和P40高于LLOQ。毒杀芬总含量则低于检出限。有报道指出在美国南加州毒杀芬的使用量很小^{[ 36 ]},表3的数据表明这一地区基本没有毒杀芬的污染。

表 3 蒂华纳河口沉积物中总毒杀芬和8个毒杀芬同类物的含量 Table 3 Contents of total toxaphene and the eight congeners in the sediments of Tijuana River estuary ng/g (dry weight) Congener Stations TJR6001 TJR6004 TJR6009 TJR6010 TJR6012 (n=2) Hx-Sed ≤ 0.020 ≤ 0.020 0.050 ≤ 0.020 0.090±0.028 Hp-Sed ≤ 0.030 ≤ 0.030 0.080 ≤ 0.040 0.150±0.038 P26 ≤ 0.01 ≤ 0.01 ≤ 0.033 ≤ 0.01 ≤ 0.033 P41 ≤ 0.002 ≤ 0.002 ≤ 0.007 ≤ 0.002 ≤ 0.007 P40 ≤ 0.010 0.150 0.090 ≤ 0.020 0.100±0.024 P44 ≤ 0.008 ≤ 0.008 ≤ 0.027 ≤ 0.008 ≤ 0.027 P50 ≤ 0.006 ≤ 0.006 ≤ 0.020 ≤ 0.006 ≤ 0.020 P62 ≤ 0.01 ≤ 0.01 ≤ 0.033 ≤ 0.01 ≤ 0.033 Total toxaphene < 5.00 < 5.00 < 5.00 < 5.00 < 5.00 Note: ≤, detected, but less than LLOQ; <, not detected.

表 3 蒂华纳河口沉积物中总毒杀芬和8个毒杀芬同类物的含量 Table 3 Contents of total toxaphene and the eight congeners in the sediments of Tijuana River estuary ng/g (dry weight)

三文鱼样品中毒杀芬含量见表4,其中的数据是2个平行样的平均值和标准偏差。三文鱼样品的含水量为74% ,脂肪含量为33.3%干鱼肉重。以2.5 g干鱼肉重为基准,P62的LLOQ是1.0 ng/g,其他7个毒杀芬同类物的LLOQ是0.1 ng/g,总毒杀芬的LLOQ是10 ng/g。若以鱼肉的湿重为基准,LLOQ分别是0.26、0.026和2.6 ng/g。若以2.5 g干鱼肉中的0.83 g脂肪重为基准,LLOQ分别是3、0.3和30 ng/g。所有8个毒杀芬同类物都被检出,除Hx-Sed外,都高于LLOQ。毒杀芬总含量也高于LLOQ。

表 4 三文鱼样品中总毒杀芬和8个毒杀芬同类物的含量(n=2) Table 4 Contents of toxaphene and the eight congeners in the salmon fish tissue (n=2) Congener Contents ng/g (dry weight) ng/g (wet weight) ng/g (lipid) Hx-Sed ≤0.041±0.005 ≤0.011±0.001 ≤0.131±0.002 Hp-Sed 0.124±0.009 0.032±0.002 0.4±0.014 P26 0.439±0.059 0.114±0.015 1.42±0.034 P41 0.124±0.015 0.032±0.004 0.399±0.004 P40 0.412±0.045 0.107±0.012 1.33±0.01 P44 0.478±0.018 0.124±0.005 1.55±0.113 P50 0.655±0.002 0.170±0.001 2.13±0.227 P62 0.248±0.009 0.064±0.002 0.80±0.0594 Total toxaphene 17.3±2.55 4.50±0.662 55.9±2.1

表 4 三文鱼样品中总毒杀芬和8个毒杀芬同类物的含量(n=2) Table 4 Contents of toxaphene and the eight congeners in the salmon fish tissue (n=2)