HILIC的概念由Alpert[ 4 ]在1990年提出,在HILIC模式下,流动相通常为水(在流动相中的比例＜40% )和有机溶剂(一般为乙腈),固定相为亲水的极性材料。HILIC固定相具有多样性的特点,除了传统的硅胶、氨丙基键合硅胶外,还包括各种官能团修饰的硅胶,如酰胺基、糖基、两性离子等[ 5, 6, 7 ]。HILIC固定相表面修饰着各种极性官能团,因此表现出不同的色谱性能,不少工作研究了模型化合物在各种HILIC固定相上的保留行为[ 7, 8, 9 ]。作为HILIC重要的研究对象之一[ 10, 11, 12, 13 ],有必要对糖类化合物在HILIC模式下的保留行为开展系统评价。Orth等[ 14 ]研究了一些单糖、二糖和三糖在氨基修饰的色谱柱上的保留行为,初步探讨了亲水色谱的保留机理,认为糖类化合物的保留时间与其极性和大小有关。Armstrong等[ 15 ]研究了寡糖在 β -CD色谱柱上的保留行为,认为在分离过程中极性和(或)氢键作用控制了寡糖的保留行为。Deguchi等[ 16 ]考察了中性和唾液酸化的寡糖在两性离子固定相(ZIC-HILIC)上的保留行为,推测中性寡糖的保留行为受亲水作用的影响,酸性寡糖的保留除了受亲水作用的影响外,很大程度上受静电作用的影响。由此可见,糖类化合物的保留机理复杂,其保留行为与糖类化合物的结构、固定相材料和流动相组成等均有关系,因此较难预测。
虽然上述文献在研究糖类化合物在HILIC模式下的保留行为时,都讨论了流动相组成对溶质保留因子的影响趋势,但都未使用保留方程对糖类化合物的保留行为做出定量的描述。随着HILIC在糖类化合物分离中的应用范围越来越广,需要建立一种保留方程,可以定量地描述糖类化合物在HILIC模式下的保留行为,从而有利于预测糖类化合物的保留时间及优化其色谱条件。
本文以糖类化合物(单糖、二糖、三糖)为研究对象,考察各种色谱条件参数对其保留行为的影响,并选择合适的色谱模型建立糖类化合物的保留方程,完成对其在亲水模式下保留规律的定量描述。
Waters高效液相系统,包括2965梯度泵、自动进样器、柱恒温系统、2420蒸发光散射检测器、Empower色谱工作站。色谱柱:麦芽糖色谱柱(Click Maltose, 150 mm×4.6 mm, 5 μ m,自制[ 17 ])、Venusil HILIC色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m, Agela, USA)和TSK-GEL Amide-80色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μ m, TOSOH, Japan)。
5种糖类化合物标准品:山梨糖(sorbose)、葡萄糖(glucose)、蔗糖(sucrose)、海藻糖(trehalose)和松三糖(melezitose),均购自Dr. Ehrenstorfer GmbH (Augsburg， Germany)。称取适量的标准品用50%(v/v)的乙腈水溶液溶解配制成混合标准溶液备用。
乙腈(Merck)、甲醇(Merck)、丙酮(Kermel)均为色谱纯；Milli-Q超纯水(Millipore)。甲酸铵和甲酸购自Acros(New Jersey, USA)。100 mmol/L 甲酸铵缓冲溶液:称取6.3 g甲酸铵固体溶入1 L水中制得,并用甲酸将其pH值调至3.0。
药材及样品处理:取干燥的地黄药材25 g,粉碎,用250 mL水煎煮120 min。固液分离后,固体继续用250 mL水再煎煮90 min。合并两次煎煮液,喷雾干燥。称取上述地黄干粉10 mg,溶于1 mL水中,使用石墨化碳进行预处理[ 18 ],收集15%(v/v)的乙腈水溶液洗脱部分,氮气吹干后,溶于200 μ L 50%(v/v)的乙腈水溶液中,备用。
流动相:A相为乙腈,B相为水,C相为100 mmol/L 甲酸铵缓冲液(pH 3.0);考察有机溶剂影响时将乙腈换为甲醇或丙酮;用于建立保留方程的保留时间测定时使用A、B两相,B相体积比依次为10% 、15% 、20% 、25% 、30% 、35%和40% ,预测保留时间时B相体积比为22% ;考察缓冲盐浓度影响时,A相体积比为78% , C相体积比依次为0、5% 、10% 、15%和20% ;每个实验重复两次;流速:1.0 mL/min;柱温:30 ℃;检测器:蒸发光散射检测器(ELSD),参数设置为吹扫氮气压力为2.07×105 Pa,漂移管温度85 ℃,增益值10;保留因子(k):k=(tR-t0)/t0,其中,tR为溶质保留时间,t0为死时间。t0的测定方法:流动相为100%乙腈时,进样0.5 μ L甲醇得到的保留时间。实验测得麦芽糖色谱柱的死时间为1.912 min。
本文选择了5种糖类化合物标准品为研究对象,考察流动相组成变化对其保留行为的影响。糖类化合物的结构如图1所示。
首先研究了流动相中不同比例的水相条件下糖类化合物在麦芽糖色谱柱上的保留时间变化趋势。从图2可以看出,极性相对最小的单糖(山梨糖和葡萄糖)最先被洗脱,接下来是二糖(蔗糖和海藻糖),最后是三糖(松三糖);同时,随着流动相中水相比例的不断增加,溶质的保留因子都迅速降低。上述现象证明,糖类化合物在麦芽糖色谱柱上的保留行为具有典型的亲水作用色谱的特点。
本文还考察甲醇和丙酮对糖类化合物保留行为的影响。当流动相为78%甲醇时,糖类化合物很难在色谱柱上保留,5 min内全部被洗脱出来(见图3a),即使将甲醇比例提高至90% ,糖类化合物依然很难保留(见图3d)。甲醇为典型的质子化溶剂,易形成氢键,可与水分子竞争固定相表面的活性位点,破坏富水层的形成,使固定相表面的疏水性增强,从而导致溶质难以保留[ 19 ]。丙酮和乙腈都是非质子的溶剂,具有相似的极性,已有文献报道使用丙酮作为有机溶剂,用于分离糖类化合物[ 20 ]。图3b证明,丙酮作为亲水色谱中的有机溶剂可以有效分离糖标准品。和乙腈相比(图3c),溶质的保留时间较短,可通过适当提高丙酮的比例来延长保留时间,使其完全分离。
本文考察了糖类化合物在麦芽糖色谱柱(Click Maltose, 150 mm×4.6 mm, 5 μ m)、Venusil HILIC色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m)和TSK-GEL Amide-80色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μ m)3种固定相上的保留行为。糖类化合物在3种色谱柱上的分离谱图见图4。
由图4可见5种糖类化合物标准品在3种色谱柱上均可有效分离,依照化合物的极性由弱到强的顺序先后洗脱,符合亲水色谱的特点。TSK-GEL Amide-80和Venusil HILIC固定相是酰胺基团修饰的硅胶,麦芽糖色谱柱的固定相是麦芽糖分子修饰的硅胶,尽管官能团不同,但都可以达到使糖类化合物在色谱柱上保留的目的。糖类化合物标准品在TSK-GEL Amide-80色谱柱上的保留时间最长,麦芽糖次之,在Venusil HILIC色谱柱上的保留时间最短。此外,TSK-GEL Amide-80色谱柱还可对葡萄糖的 α / β 差向异构体进行有效识别。由此可见,固定相不同,分离表现也有所差异,针对极性化合物的特点,可以选择不同极性官能团修饰的固定相,所以亲水作用色谱固定相具有很大的发展空间。
和反相色谱相似,亲水色谱模式下也常添加缓冲盐,用以调控溶质保留时间和固定相的选择性。考察了在麦芽糖色谱柱上甲酸铵浓度变化对糖类化合物保留行为的影响,流动相中甲酸铵浓度由0增加至20 mmol/L,山梨糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖和松三糖的保留时间分别增加了16.6% 、17.4% 、18.9% 、20.8%和24.0% ,符合亲水色谱模式的保留特点。
亲水模式下,极性化合物受到分配作用及其他多种作用的影响,理论上讲,若lnk与CB(流动相中水相的体积分数)呈线性关系[ 21 ],则亲水模式的保留机理以分配过程为主;若lnk与lnCB呈线性关系[ 22, 23 ],则说明亲水模式下的保留主要受吸附机理控制。从图2可以看出,根据两种机理绘制的曲线,其线性关系均不是很好,说明糖类化合物在麦芽糖色谱柱上的保留受到多重机理的影响,单一使用分配机理或吸附机理都不能准确地描述溶质的保留行为。
为了更好地描述亲水模式的保留机理,本文采用了卢佩章等[ 24 ]提出的顶替吸附-液相相互作用模型,该模型中的溶质保留因子与流动相中的强洗脱溶剂之间存在如下关系:lnk=a+blnCB+cCB,其中,参数a是与溶质和固定相的相互作用能、溶质同流动相中溶剂的相互作用能以及溶质分子体积相关的常数;参数b是与固定相表面溶质分子顶替流动相中强溶剂的分子数相关的常数;参数c是与溶质和流动相中溶剂的作用能相关的常数。根据保留方程,计算得到了糖类化合物标准品在麦芽糖色谱柱上的回归结果(见表1),其回归系数均大于 0.9999,说明顶替吸附-液相相互作用模型适用于定量描述糖类化合物在亲水模式下的保留行为。通过建立回归方程,可得到5个糖标准品的a、b、c参数值,见表1。根据表1中的结果,参数b的绝对值呈逐渐增大的趋势,而参数c的绝对值却逐渐减少,从侧面也反映出随着糖聚合度的增加,吸附机理对溶质保留行为的影响可能在逐步加大,而分配机理的影响在逐渐降低。对于本研究中的糖类化合物来说,吸附作用主要是来自直接氢键作用,即糖类化合物结构中的羟基与硅胶表面修饰的麦芽糖分子之间的相互作用。由此可见,亲水模式的保留机理会受到溶质和固定相性质的影响,在研究包含羟基的化合物(如糖类化合物)在羟基修饰的固定相(如麦芽糖色谱柱)上的保留行为时,氢键作用是重要的影响因素。根据得到的参数a、b、c值,可通过保留方程预测溶质在其他流动相条件下的保留时间并进行优化,从而达到最佳分离的目的。基于上述数据,对5个糖类化合物标准品在78%A/22%B的流动相条件下的保留时间进行了预测,并与实验结果进行了比较(见表1)。与实际测定的保留时间相比,预测结果的相对误差较小,最大值仅有1.52% 。所以,顶替吸附-液相相互作用模型适合用于定量描述糖类化合物在亲水模式下的保留行为,可进一步用于对实际样品中糖类化合物的保留行为的预测。
地黄为玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)的新鲜或干燥块根,地黄中含有蔗糖、棉籽糖、水苏糖、毛蕊花糖等糖类化合物。本文选择地黄样品作为研究对象,用于考察顶替吸附-液相相互作用模型对实际样品中糖类化合物保留行为描述的准确性。图5所示为地黄样品在麦芽糖色谱柱上的分离谱图。基于保留公式,测定样品中7个糖类化合物在水相体积比分别为40% 、37% 、35% 、32% 、27%和25%时的保留时间,计算a、b、c值,并对其在水相体积比为30%时的保留时间进行预测,结果见表2。7个化合物保留方程的回归系数均大于0.999,预测的保留时间与实验结果之间的相对误差小于0.3% ,进一步证明了顶替吸附-液相相互作用模型的准确性,适合用于定量描述实际样品中糖类化合物的保留行为。
本文以5种糖标准品(山梨糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖和松三糖)为研究对象,对其在亲水模式下的保留行为进行了较为深入的研究。考察了流动相、固定相、缓冲盐等实验条件对溶质保留行为的影响。评价结果表明,本研究中使用的中性糖类化合物在麦芽糖色谱柱(Click Maltose)上的保留行为具有典型的HILIC特点。进一步,采用了顶替吸附-液相相互作用模型对糖类化合物的保留行为进行定量描述,并将保留公式lnk=a+blnCB+cCB应用于地黄样品中糖类化合物保留时间的预测,得到了较好的实验结果。本文对糖类化合物在HILIC模式下的保留行为进行了较为系统的评价,评价结果有助于糖类化合物HILIC分离方法的建立;同时,本文采用的保留方程可准确描述糖类化合物的保留行为,预测其保留时间,从而有助于糖类化合物HILIC分离方法的优化。
2013, Vol. 31 Issue (11): 1051-1056
PDF (802KB)
2013, Vol. 31 Issue (11): 1051-1056
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