液相色谱-串联质谱法测定淀粉及其制品中的顺丁烯二酸与顺丁烯二酸酐总含量


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徐敦明¹, 陈燕¹, 周爽¹, 连英杰¹, 陈鹭平¹, 林立毅¹, 周昱¹, 黄志强²

1. 厦门出入境检验检疫局, 福建厦门 361026;
2. 湖南省检验检疫科学研究院, 湖南长沙 410004

收稿日期：2013-7-8

基金项目：国家科技支撑计划项目（2012BAK08B01）；厦门市科技计划项目（3502Z20092009）

通讯作者：黄志强,E-mail:huangzqq@126.com.

摘要：建立了测定淀粉及其制品中顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐总含量的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）方法。样品经50%（v/v）甲醇提取、碱性条件下水解后，采用液相色谱-串联质谱对其进行分析，外标法定量。质谱分析采用电喷雾电离，负离子扫描，多反应监测模式。实验表明样品无明显的基质效应，添加水平为0.5~1000 mg/kg时，回收率为80.2%~115.3%，相对标准偏差（n=6）小于12%；方法检出限（LOD）为0.1 mg/kg，定量限（LOQ）为0.5 mg/kg。该方法提取效果好，具有良好的灵敏度、回收率和重复性，已被成功用于实际样品中顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐总含量的测定。

关键词：高效液相色谱-串联质谱顺丁烯二酸顺丁烯二酸酐淀粉及其制品

Determination of the total amount of maleic acid and maleic anhydride in starch and its products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

XU Dunming¹, CHEN Yan¹, ZHOU Shuang¹, LIAN Yingjie¹, CHEN Luping¹, LIN Liyi¹, ZHOU Yu¹, HUANG Zhiqiang²

1. Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen 361026, China;
2. Hunan Academy of Inspection and Quarantine, Changsha 410004, China

Received: 2013-7-8

Abstract: A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) method was established for the determination of the total amount of maleic acid and maleic anhydride in starch and its products. The samples were extracted with 50% (v/v) methanol and hydrolyzed by alkaline, then analyzed by HPLC-MS/MS, and quantified with the external standard method. The mass spectrometry was operated with electrospray in negative ionization mode. The multiple reaction monitoring (MRM) mode was employed involving the transition of the precursor ion to two selected product ions, in which one pair was for quantification (m/z 115.0>71.1) and the other pair was for identification (m/z 115.0>27.1). The results indicated that no significant matrix effect was found for the spiked samples. The recoveries of maleic acid spiked in starch and its products were 80.2%-115.3% at spiked levels of 0.5-1000 mg/kg. The relative standard deviations (RSDs) were less than 12% (n=6). The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were 0.1 and 0.5 mg/kg for maleic acid and maleic anhydride, respectively. The method is rapid, sensitive and reproducible for the determination of the total amount of maleic acid and maleic anhydride in starch and its products and shows great potential for routine analysis

Key words: high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) maleic acid maleic anhydride starch and its products

在台湾地区曾发现,为了减低成本或增加口感,部分粉圆、芋圆等市售淀粉产品违规使用工业用黏着剂顺丁烯二酸酐(maleic anhydride,见图1a)。顺丁烯二酸酐又名马来酸酐,是工业原料^{[ 1, 2 ]},遇水变成顺丁烯二酸(或称马来酸,maleic acid,图1b)。顺丁烯二酸亦微量存在于苹果酸或反丁烯二酸(富马酸)等合法的食品添加剂中。美国及欧盟有限度地允许在和食品直接或间接接触的包装材料中使用顺丁烯二酸酐^{[ 3 ]}。顺丁烯二酸酐和顺丁烯二酸不在台湾地区的食用淀粉使用添加剂核准名单内,也不在我国食品安全国家标准允许使用的食品添加剂品种列表内^{[ 4 ]}。

图 1 (a)顺丁烯二酸酐和(b)顺丁烯二酸的结构式 Fig. 1 Structures of (a) maleic anhydride and (b) maleic acid

关于顺丁烯二酸与顺丁烯二酸酐的测定方法主要包括化学显色法^{[ 5 ]}、分光光度法^{[ 6 ]}、气相色谱法^{[ 7 ]}、液相色谱法^{[ 8, 9, 10, 11, 12, 13 ]}等。其中显色法灵敏度差,特异性也不强;气相色谱法分析有机酸通常需经衍生反应,操作繁琐;液相色谱法最为常见,包括离子对色谱法^{[ 9 ]}、正相色谱法^{[ 10 ]}、反相色谱法^{[ 13 ]}等,但无法进行定性确证。目前关于食品中顺丁烯二酸与顺丁烯二酸酐总含量的液相色谱-串联质谱测定方法未见报道。本文建立了适用于淀粉及其制品中顺丁烯二酸与顺丁烯二酸酐总含量的液相色谱-串联质谱测定方法,可准确地进行定性和定量测定,操作简单、灵敏度高、准确性好。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

配有电喷雾离子源和三重四极杆质谱检测器的高效液相色谱-串联质谱仪(Shimadzu LCMS-8040或Agilent 6460), C₁₈柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μ m);离心机(TGL-16GB,上海安亭科学仪器厂)。

C₁₈ QuEChERS净化填料(Agilent公司);甲醇和乙腈(色谱纯,Tedia公司);甲酸(色谱纯,Fluka公司);其他试剂均为分析纯;实验用水为去离子水。顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐标准品(纯度＞ 99% , Fluka公司)。

标准溶液的配制:准确称取顺丁烯二酸(CAS No.110-16-7)或顺丁烯二酸酐(CAS No. 108-31-6)100 mg(精确至0.01 mg),以水为溶剂配制成 1000 mg/L 标准储备液,于0～4 ℃保存。实验中根据需要进行稀释。

1.2 样品预处理

称取1.0 g样品,加入50%(v/v)甲醇水溶液25 mL进行涡旋振荡提取2 min;超声15 min,加入0.5 mol/L 氢氧化钾溶液20 mL,混匀后静置1 h。加入5 mol/L 盐酸溶液3 mL后溶液呈酸性(pH 4～5),用去离子水定容至50 mL。针对样品是否含有油脂,分别继续进行以下处理:对不含油脂样品的定容溶液,以 4000 r/min 离心3 min,取上清液过膜后供液相色谱-串联质谱测定;对含油脂样品的定容溶液,取上清液1 mL加入50 mg C₁₈ QuEChERS净化填料,涡旋振荡1 min, 4000 r/min 离心3 min,取上清液过膜后供液相色谱-串联质谱测定。

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱: C₁₈柱;色谱柱温度:35 ℃;流动相A: 0.1%甲酸水溶液;流动相B:乙腈;进样量:5 μ L。洗脱梯度:0～3 min,流动相A为98% ;在3.1 min时溶液A变化至10% ,保持3 min;在6.1 min时溶液A变化至98% ,平衡4 min;流速:0.2 mL/min。

1.3.2 质谱条件

扫描方式:电喷雾负离子(ESI^-)扫描;检测方式:多反应监测(MRM);辅助加热气:氮气12 L/min;加热温度:350 ℃;喷雾电压:3500 V;定量和定性离子对、碰撞能量等参数见表1。

表 1 顺丁烯二酸的质谱检测参数 Table 1 Parameters of MS/MS for maleic acid

1.4 添加回收试验

准确添加顺丁烯二酸标准溶液于空白样品中，使样品浓度为0.5、1.0、10、1000 mg/kg,备用。按1.2和1.3节分析方法操作,测定回收率,每个浓度重复测定6次,计算相对标准偏差(RSD)。

1.5 定量方法

顺丁烯二酸酐遇水变成顺丁烯二酸,在分析中实际目标物为顺丁烯二酸。样品中顺丁烯二酸酐和顺丁烯二酸的总量以顺丁烯二酸计。根据试样中被测物的含量,选取响应值适宜的标准工作溶液进行分析。标准工作液和待测样液中顺丁烯二酸的响应值均应在仪器线性响应范围内。如果含量超过标准曲线范围,稀释到合适浓度后分析。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱-串联质谱测定条件的确定

在电喷雾负离子方式下对顺丁烯二酸进行一级质谱分析Q1扫描,得到分子离子,即母离子(见图2)。对分析化合物的分子离子进行二级质谱分析(子离子扫描),得到碎片离子(即子离子)信息:m/z 71是顺丁烯二酸去 - COOH 得到,m/z 27是顺丁烯二酸去两个 - COOH ,形成 - C = C - 加H得到(见图3)。然后优化顺丁烯二酸的二级质谱参数,使分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大,得到分析物的二级质谱图;按照二级质谱图提供的碎片离子信息,选择定性和定量离子对。目标物的MRM色谱图见图4。

图 2 顺丁烯二酸母离子Q1扫描图 Fig. 2 Mass spectrum of maleic acid with Q1 scan

图 3 顺丁烯二酸碎片离子的二级质谱图 Fig. 3 MS/MS spectrum of the product ions of maleic acid

图 4 顺丁烯二酸(1 mg/L)的MRM色谱图 Fig. 4 Chromatograms of maleic acid (1 mg/L) in MRM mode a. total ion chromatogram; b. m/z 115.0/27.1; c. m/z 115.0/71.1.

2.2 方法的线性关系及灵敏度

用标准溶液配制顺丁烯二酸工作液(质量浓度为0.01、0.02、0.05、0.1、1 mg/L),进样5 μ L,以质量浓度(X, mg/L)为横坐标,定量离子对的峰面积(Y)为纵坐标建立标准曲线,线性方程为Y=10.477X-0.0573,相关系数(r²)为 0.9996,相关性好。

逐级稀释空白加标样品并测定,以S/N=3和S/N=10确定检出限(LOD)和定量限(LOQ)，分别为0.1和0.5 mg/kg。而文献^{[ 11, 12 ]}报道的液相色谱法检出限或定量限均高于5 mg/kg,因此本方法具有更高的灵敏度。

2.3 方法的准确度和精密度

在淀粉、粉圆、黑轮、条粄(河粉)、鱼丸等6种样品中进行添加回收试验。目标物与基体杂质分离很好,不受基体杂质干扰。每个浓度平行测定6次,结果见表2。6种基质中的回收率在80.2% ～115.3%之间,相对标准偏差为3.0% ～11.2% ,均符合残留分析要求。在进行添加回收试验时,加入适量的碱可使顺丁烯二酸酐以盐的形式存在,便于提取。实验表明,如不进行碱解,回收率低于50% 。按1.2节方法进行顺丁烯二酸酐的添加回收试验，回收率、相对标准偏差等技术指标符合相关要求。

表 2 不同基质中顺丁烯二酸的加标回收率和方法的精密度(n=6) Table 2 Recoveries and precisions of maleic acid spiked in the six matrices (n=6)

2.4 实际样品的检测

利用建立的分析方法对一批淀粉及其制品进行了测定,其中有18个样品检出顺丁烯二酸,检出含量为4.2～892.6 mg/kg。

3 结论

建立了淀粉及其制品中顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐总量的分析方法,样品采用甲醇提取和碱性条件下水解,液相色谱-串联质谱测定。利用建立的方法对实际样品进行了分析。方法的灵敏度高,回收率良好,能适用于食品中顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐总量的测定。

参考文献

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本文献在全文中的定位：

... 是工业原料^{[ 1, 2 ]} ...

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... 美国及欧盟有限度地允许在和食品直接或间接接触的包装材料中使用顺丁烯二酸酐^{[ 3 ]} ...

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... 也不在我国食品安全国家标准允许使用的食品添加剂品种列表内^{[ 4 ]} ...

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...关于顺丁烯二酸与顺丁烯二酸酐的测定方法主要包括化学显色法^{[ 5 ]}、分光光度法^{[ 6 ]}、气相色谱法^{[ 7 ]}、液相色谱法^{[ 8 ]}...

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